手足口病毒中和剂鉴定试验

发布时间：2025-07-01 11:42:58 阅读量：1 作者：生物检测中心

手足口病毒中和剂鉴定试验

摘要： 手足口病（HFMD）是一种由肠道病毒（主要为柯萨奇病毒A16型（CVA16）和肠道病毒71型（EV71））引起的儿童常见传染病。有效的消毒措施是阻断其传播的关键环节。中和剂鉴定试验是评价消毒剂对特定病毒灭活效果及其中和剂选择合理性的核心实验方法。本试验以Vero细胞为宿主细胞，采用细胞病变效应（CPE）法，通过严谨的组别设置，验证了某候选中和剂对目标手足口病毒（CVA16和EV71）的有效中和能力，为后续消毒剂灭活效果评价提供了方法学基础。

关键词： 手足口病；肠道病毒；柯萨奇病毒A16；肠道病毒71；中和剂鉴定试验；病毒灭活；消毒剂评价

一、 引言

手足口病（Hand, Foot and Mouth Disease, HFMD）是由多种肠道病毒引起的急性传染病，主要病原体为柯萨奇病毒A组16型（Coxsackievirus A16, CVA16）和肠道病毒71型（Enterovirus 71, EV71）。该病多发于5岁以下儿童，临床表现主要为手、足、口腔等部位的皮疹、疱疹和溃疡，重症病例可累及神经系统，甚至导致死亡。病毒主要通过接触传播（如接触患者疱疹液、呼吸道分泌物、粪便或被污染的物体表面）以及飞沫传播。因此，环境物品的彻底消毒对于控制HFMD的传播至关重要。

评价消毒剂对特定病原微生物灭活效果的标准试验方法中，常涉及消毒剂作用后残留消毒剂的去除问题。残留消毒剂若未被有效去除，会在后续检测步骤中继续发挥杀灭或抑制作用，导致对消毒剂真实灭活效力的高估（假阴性结果）。中和剂鉴定试验（Neutralization Efficacy Test）的核心目的即在于：筛选并验证能够及时、完全地中止消毒剂的持续作用，且本身对实验体系（宿主细胞、培养基、指示微生物）无毒性的化学物质（中和剂）。通过该试验确认有效中和剂是进行后续定量悬浮试验、载体试验等消毒剂灭活效果评价研究的必要前提。

本试验依据《消毒技术规范》及相关病毒学标准方法，采用细胞培养技术，旨在鉴定某候选中和剂溶液对目标手足口病毒（CVA16和EV71）是否具有有效的中和能力。

二、 材料与方法

  1. 病毒株：

    • 柯萨奇病毒A组16型（CVA16）标准株
    • 肠道病毒71型（EV71）标准株
    • 病毒滴度要求：试验前需测定病毒悬液的50%组织细胞感染剂量（TCID₅₀/mL），通常要求≥ 10⁶.⁰ TCID₅₀/mL以保证试验灵敏度。

  2. 细胞系：

    • 非洲绿猴肾细胞（Vero细胞）
    • 细胞培养条件：使用含10%胎牛血清（FBS）、青霉素（100 U/mL）、链霉素（100 μg/mL）的Eagle's MEM培养基，于37℃、5% CO₂培养箱中培养。

  3. 培养基与试剂：

    • 细胞生长培养基（含10% FBS）
    • 细胞维持培养基（含2% FBS）
    • 磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.2-7.4）
    • 候选中和剂溶液： 根据预实验或文献初步筛选确定成分与浓度（如：硫代硫酸钠+卵磷脂+吐温80+组氨酸+半胱氨酸等组合，具体浓度略）。
    • 消毒剂（阳性对照用）： 目标消毒剂原液（作用浓度）。
    • 胰蛋白酶-EDTA溶液（0.25%）
    • 中性红染色液（可选，用于结果观察）

  4. 主要仪器设备：

    • CO₂培养箱
    • 生物安全柜（BSL-2级）
    • 倒置显微镜
    • 恒温水浴箱
    • 离心机
    • 微量移液器及无菌吸头
    • 96孔细胞培养板
    • 细胞培养瓶

  5. 试验分组设计：
    试验设立以下关键组别，每组设3-6个重复孔：

    • 病毒对照组（Virus Control, VC）： 病毒悬液 + 细胞维持培养基。
    • 中和剂对照组（Neutralizer Control, NC）： 中和剂溶液 + 细胞维持培养基 + 病毒悬液。
    • 中和产物对照组（Neutralizer-Virus Product Control, NVPC）： 中和剂溶液 + 病毒悬液（作用后） + 细胞维持培养基。
    • 消毒剂对照组（Disinfectant Control, DC）： 消毒剂（作用浓度） + 细胞维持培养基。
    • 残留消毒剂中和试验组（Test Group, TG）： 消毒剂（作用浓度） + 病毒悬液（作用后） + 中和剂溶液 + 细胞维持培养基。
    • 细胞对照组（Cell Control, CC）： 仅细胞维持培养基（无病毒、无消毒剂、无中和剂）。

  6. 试验步骤：

    1. 细胞准备： 将处于对数生长期的Vero细胞消化后，用生长培养基调整细胞密度，接种于96孔板，每孔100 μL（约1–2×10⁴个细胞/孔）。置37℃、5% CO₂培养箱中培养至形成单层（约24-48小时）。
    2. 病毒悬液制备： 取冻存的病毒株，复苏后接种于Vero细胞单层进行扩增。收获出现明显CPE（约75%以上）的细胞培养物，反复冻融3次，离心取上清，分装，-80℃保存备用。试验前滴定病毒滴度（TCID₅₀/mL）。
    3. 中和剂溶液配制： 按预定配方配制候选中和剂溶液，过滤除菌备用。
    4. 试验组处理（关键步骤）：
      • VC组： 取100 μL病毒悬液（约100 TCID₅₀）直接加入含细胞单层的孔中。
      • NC组： 取50 μL中和剂溶液与50 μL病毒悬液（约100 TCID₅₀）在无菌小管中混匀，中和作用一定时间（如5-10分钟）后，取100 μL混合物加入含细胞单层的孔中。
      • NVPC组： 同NC组操作，取100 μL中和剂-病毒混合物加入含细胞单层的孔中。
      • DC组： 取100 μL目标消毒剂（作用浓度）加入含细胞单层的孔中。
      • TG组： 模拟消毒过程： 取50 μL目标消毒剂（作用浓度）与50 μL病毒悬液（约100 TCID₅₀）在无菌小管中混匀，作用预定时间（如1-30分钟，根据消毒剂特性设定）。作用结束后，立即加入100 μL中和剂溶液，混匀，中和作用预定时间（如5-10分钟）。取100 μL该最终混合物（消毒剂+病毒+中和剂）加入含细胞单层的孔中。
      • CC组： 加入100 μL细胞维持培养基。
    5. 培养与观察： 将96孔板置于37℃、5% CO₂培养箱中培养。每日在倒置显微镜下观察各孔细胞病变效应（CPE）情况（细胞变圆、肿胀、脱落、崩解等），连续观察5-7天或直至VC组出现稳定且完全的CPE。
    6. 终点判定（CPE法）： 记录各孔出现CPE的情况（阳性：有CPE；阴性：无CPE）。当VC组大部分孔（如≥80%）出现CPE，CC组和DC组均无CPE时，可进行结果判定。
 

三、 结果判定标准

中和剂鉴定试验结果需满足以下所有条件，方可认为该候选中和剂适用于后续针对该手足口病毒和目标消毒剂的灭活试验：

  1. 病毒对照组（VC）： 必须呈现明显的病毒增殖（即出现CPE），证明病毒具有感染性且试验体系有效。
  2. 中和剂对照组（NC）： 必须无CPE出现（或滴度显著低于VC组，通常要求Log10降低值≤0.5），证明中和剂本身对细胞无毒，且单独存在时不抑制病毒活性。
  3. 中和产物对照组（NVPC）： 必须出现CPE，且其病毒滴度（Log10 TCID₅₀/mL）与VC组相比，降低值应≤0.5 Log₁₀。证明中和剂与病毒混合后不影响病毒对细胞的感染能力。
  4. 消毒剂对照组（DC）： 必须无CPE出现，证明所用浓度的消毒剂对细胞无毒性，避免干扰结果判定。
  5. 残留消毒剂中和试验组（TG）： 必须出现CPE，且其病毒滴度（Log10 TCID₅₀/mL）与VC组相比，降低值应≤0.5 Log₁₀。这是最关键的条件，证明加入的中和剂有效中止了残留消毒剂的作用，使未被灭活的病毒得以感染细胞并产生CPE。若TG组无CPE或滴度远低于VC组，表明中和剂无效或存在毒性，残留消毒剂未被完全中和或中和剂本身抑制了病毒。
  6. 细胞对照组（CC）： 必须无CPE出现，证明细胞状态良好，无污染。
 

四、 应用价值与意义

通过严格的中和剂鉴定试验，可筛选出对特定手足口病毒（如CVA16、EV71）和目标消毒剂有效的化学中和剂。其核心价值在于：

  1. 保证评价结果准确性： 有效中和残留消毒剂，防止其对后续检测步骤（如病毒培养）产生干扰，避免假阴性结果（高估消毒效果）或假阳性结果（低估消毒效果），确保消毒剂灭活效力评价数据的真实、可靠。
  2. 标准化评价流程： 为开展后续定量评价手足口病毒消毒剂灭活效果的标准化试验（如悬液定量杀菌试验、载体浸泡试验、现场模拟试验等）提供必不可少的技术基础。没有经过验证的有效中和剂，这些评价试验的结果将失去科学意义。
  3. 指导消毒实践： 基于科学验证的评价结果，可以为医疗机构、托幼机构、家庭等场所选择和使用针对手足口病毒有效的消毒剂及其正确使用方法（浓度、时间）提供科学依据，从而更有效地切断传播途径，控制疫情。
  4. 新产品研发支持： 在新消毒剂的研发过程中，中和剂鉴定试验是验证其宣称抗病毒效果（特别是对手足口病毒）的关键环节，为产品注册和上市提供必要的实验数据。
 

五、 结论

手足口病毒中和剂鉴定试验是评价消毒剂灭活效果研究链条中的关键基石。本试验采用细胞培养技术（CPE法），通过设计严谨的对照组合（VC, NC, NVPC, DC, TG, CC），验证了特定中和剂溶液对手足口病毒主要病原体（CVA16和EV71）及目标消毒剂残留的有效中和能力。只有当中和剂满足所有判定标准（特别是TG组出现CPE且与VC组滴度差异≤0.5 Log₁₀），才能确认该中和剂适用于后续的消毒剂灭活效果定量评价试验。严格遵循此方法，是获得科学、准确、可比对的手足口病毒消毒效果评价数据的前提，对有效防控手足口病传播具有重要的公共卫生意义。

参考文献 (格式示例，需根据实际引用补充完整)

  1. 中华人民共和国卫生部. 消毒技术规范. [最新版年份].
  2. World Health Organization (WHO). Guidelines on Hand Hygiene in Health Care. Geneva: WHO Press; 2009. (或相关病毒消毒指南)
  3. Sattar SA, et al. Chemical Disinfection of Viruses. In: Block SS, ed. Disinfection, Sterilization, and Preservation. 5th ed. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins; 2001. p. 539-68.
  4. Rabenau HF, et al. Efficacy of various disinfectants against SARS coronavirus. J Hosp Infect. 2005;61(2):107-11. (示例性病毒灭活研究文献，应替换为手足口病毒相关研究)
  5. Standard Test Method for Efficacy of Virucidal Agents Intended for Inanimate Environmental Surfaces. ASTM E1053. West Conshohocken, PA: ASTM International. (或等效国际标准)