龟分枝杆菌定量杀灭试验

龟分枝杆菌定量杀灭试验指南

一、引言

龟分枝杆菌（Mycobacterium chelonae）属于非结核分枝杆菌（NTM），广泛存在于水、土壤等环境中，对多种理化因子具有较强的抵抗力。其在医疗器械污染、院内感染及耐药性研究等方面具有重要意义。定量杀灭试验是评估消毒剂、物理消毒方法或其他抗菌制剂对龟分枝杆菌杀灭效果的标准化方法，对于指导感染控制实践、评价新型消毒技术及制定相关卫生标准至关重要。

二、试验原理

本试验模拟实际应用条件，将特定浓度的龟分枝杆菌悬液暴露于待测消毒因子（如化学消毒剂溶液、物理因子作用）下一段时间。作用结束后，立即使用经确认有效的中和剂终止消毒因子的持续作用。通过系列稀释和琼脂平板培养计数残存活菌数，并与未经消毒因子处理的对照组活菌数比较，计算杀灭对数值（Log Reduction Value, LRV），从而定量评价其杀灭效果。

三、材料与试剂

1. 试验菌株： 推荐使用龟分枝杆菌标准菌株（如ATCC 35752），或经鉴定确认的临床分离株。菌种复苏、传代及保存严格按规程操作。
2. 培养基：
   • 复苏与增菌培养： 液体培养基（如Middlebrook 7H9肉汤，添加OADC生长添加剂和适量甘油）。
   • 定量培养计数： 固体培养基（如Middlebrook 7H10或7H11琼脂，添加OADC生长添加剂）。
3. 稀释液与洗涤液： 适宜的中性缓冲液（如磷酸盐缓冲盐水 PBS，pH 7.2 - 7.4），用于制备菌悬液和系列稀释。
4. 中和剂： 针对待测消毒因子类型，选择并经验证有效的中和剂（如硫代硫酸钠用于含氯消毒剂、卵磷脂-聚山梨酯80用于季铵盐类、甘氨酸或组氨酸用于醛类）。中和剂必须： 能立即、完全中和消毒作用；本身对试验菌无毒；不影响培养基性能；不影响后续培养计数。
5. 有机干扰物： 用于模拟受有机物污染的实际情况（如洁净条件、轻度污染、重度污染）。常用小牛血清或酵母提取液，按标准要求添加特定浓度（如0.3%, 3%）。
6. 试验用硬水： 配制特定硬度的水溶液用于稀释消毒剂（如欧洲标准硬水含342 mg/L CaCl₂·2H₂O）。
7. 待测消毒因子： 化学消毒剂（按使用浓度或其系列稀释度配制）、物理消毒设备（设定特定参数，如紫外线强度、照射时间、温度等）。
8. 仪器设备： 生物安全柜（Ⅲ级）、恒温培养箱（30-37°C，依菌株特性）、振荡培养箱、涡旋振荡器、无菌移液器及吸头、无菌试管、无菌平皿、菌落计数器、水浴锅（控温）、计时器等。

四、试验方法

1. 菌悬液制备：

   • 将冻存菌种接种于液体培养基中，在适宜温度下（通常30-35°C）振荡培养至对数生长期后期（通常需7-14天）。
   • 吸取培养物，离心（如3000 - 4000 g，15分钟），弃上清。
   • 用无菌稀释液/PBS洗涤沉淀2-3次，去除残留培养基成分。
   • 将沉淀重悬于适量稀释液/PBS中，涡旋振荡混匀。
   • 用比浊法（如麦氏比浊法）初步调整菌悬液浓度至约10⁹ CFU/mL，再用稀释液/PBS精确稀释至所需试验浓度（通常为1×10⁸ - 5×10⁸ CFU/mL）。

2. 中和剂鉴定试验（关键步骤）：

   • 中和剂有效性试验： 消毒剂 + 菌悬液 + 中和剂 → 培养。应无细菌生长或显著少于对照组。
   • 中和剂毒性试验： 中和剂 + 菌悬液 → 培养。菌落数应与仅稀释液/PBS + 菌悬液的对照组相当。
   • 残留消毒剂去除试验： 消毒剂 + 中和剂 + 菌悬液 → 培养。菌落数应与仅稀释液/PBS + 菌悬液的对照组相当。
   • 培养基兼容性试验： 中和剂 → 培养基。应不影响培养基凝固及透明度，不影响菌落形态生长。
   • 阳性对照： 稀释液/PBS + 菌悬液 → 培养。应生长良好。
   • 阴性对照： 培养基无菌试验。应无菌生长。
   • 仅当中和剂通过上述所有验证，方可进入正式杀灭试验。

3. 定量杀灭试验程序：

   • 试验组：
     • 在无菌试管中，加入规定体积的有机干扰物（如适用）和硬水。
     • 加入规定体积的待测消毒剂溶液（使其达到预定试验浓度），或设置好物理消毒设备参数。
     • 置于设定温度（通常20±1°C）水浴中平衡。
     • 加入规定体积的试验菌悬液（菌悬液：消毒剂体积比通常为1：9，使最终菌浓度达到10⁷ - 10⁸ CFU/mL），立即混匀并开始计时。
     • 在预定作用时间点（如1, 5, 10, 30分钟等），立即吸取1.0mL混合液加入含有9.0mL经预冷（防止微生物生长）且已确认有效的中和剂溶液的试管中（或直接置于物理因子作用终止点），充分振荡混匀，中和作用至少10分钟。
     • 对中和后的样本进行10倍系列稀释（如10⁻¹, 10⁻², 10⁻³等）。
     • 选择2-3个适宜稀释度，分别吸取0.1mL稀释液，均匀涂布于预先准备好的干燥固体培养基平板上。每个稀释度做2-3个平行。
   • 阳性对照组（菌悬液对照组）：
     • 用稀释液/PBS或硬水代替消毒剂，加入相同体积的有机干扰物（如适用）和试验菌悬液，后续步骤（稀释、涂布）同试验组。
     • 用于计算初始接种菌量（N₀）。
   • 阴性对照组： 仅中和剂溶液或稀释液/PBS涂板，应无菌生长。
   • 消毒剂/中和剂毒性对照组（若对结果有疑问时）： 仅消毒剂（作用后）+ 中和剂 + 菌悬液（在作用结束后立即加入），涂布培养。应生长良好，证明残留物无毒性。

4. 培养与计数：

   • 将涂布好的平板倒置，置于适宜温度的恒温培养箱中培养。龟分枝杆菌生长相对缓慢，通常需培养7-14天或更长时间（根据菌株和培养基确定，如EN 14348标准要求至少培养28天）。
   • 培养结束后，对平板上的菌落进行计数。选择菌落数在30-300 CFU之间的平板进行计数。记录每个稀释度的平均菌落数（CFU/mL）。

五、结果计算与评价

1. 计算各作用时间点存活菌浓度（Nt，CFU/mL）：
   • 根据平板计数结果，计算每个试验组和阳性对照组各稀释度对应的平均菌落数。
   • 乘以相应的稀释倍数，得到中和后样本中的存活菌浓度（Nt）。
2. 计算初始接种菌浓度（N₀，CFU/mL）：
   • 根据阳性对照组的结果，计算未经消毒因子作用的初始菌浓度（N₀）。
3. 计算杀灭对数值（Log₁₀ Reduction Value, LRV）：
   • LRV = Log₁₀ N₀ - Log₁₀ Nt
   • 计算同一作用时间点各平行样本的LRV，再计算其平均值。
4. 评价杀灭效果：
   • 试验通常要求阳性对照组回收菌落数达到一定数量级（如≥1×10⁷ CFU/mL），试验才有效。
   • 合格判定： 根据相关消毒标准（如医疗器械消毒高水平要求通常需达到LRV ≥ 4.00或6.00）或试验设定要求，评价在特定作用时间点、特定试验条件下（有机干扰物浓度、温度）是否达到所需的杀灭对数值。例如：
     • LRV ≥ 4.00：表示杀灭率 ≥ 99.99%
     • LRV ≥ 6.00：表示杀灭率 ≥ 99.9999%
   • 报告各作用时间点的平均LRV值及试验条件（温度、有机干扰物浓度、消毒因子浓度/强度）。

六、注意事项

1. 生物安全： 龟分枝杆菌属于危险度第2类病原微生物，所有操作必须在相应等级的生物安全柜（如Ⅱ级A2型或Ⅲ级）内进行，操作人员需穿戴个人防护装备（PPE），严格遵守实验室生物安全规程。废弃物需经有效灭菌后方可处置。
2. 菌株状态： 使用处于对数生长期、活力良好的菌悬液是试验成功的关键。避免使用陈旧或过度生长的培养物。
3. 中和剂验证： 这是试验的核心和难点所在。 必须严格按照步骤进行中和剂有效性、无毒性和残留去除验证试验。选择不合适或无效的中和剂会导致结果严重偏差（假阳性或假阴性）。
4. 有机物干扰： 根据评价目的选择是否添加以及添加何种浓度的有机干扰物，以模拟实际应用场景。有机物会显著降低某些消毒剂（如含氯消毒剂、过氧乙酸）的效果。
5. 温度控制： 试验温度（尤其是化学消毒试验）是影响杀灭效果的关键因素，必须严格控制。
6. 作用时间点选择： 应根据消毒因子的特性（速效/缓效）和预期用途，合理设置多个作用时间点，以观察杀灭动力学。
7. 混匀： 菌悬液加入消毒剂后、中和作用时、稀释过程中均需充分混匀以保证结果准确性。
8. 培养时间： 龟分枝杆菌生长缓慢，必须保证足够的培养时间（通常至少四周），避免因培养时间不足导致假阴性（计数偏低）。同时注意防止平板干燥。
9. 重复性与平行： 试验应设置足够的平行样本（通常每个处理组和稀释度≥2个平行平板），以提高结果的可靠性和统计意义。建议重复独立试验。

七、结论

龟分枝杆菌定量杀灭试验是评价消毒因子对高抗性分枝杆菌杀灭效能的金标准方法。该试验设计严谨，操作复杂，尤其强调生物安全、菌株状态控制以及中和剂的严格验证。通过规范化的操作流程和精确的结果计算（LRV），可为医疗机构的感染控制策略制定、消毒产品的注册评审与质量控制、新型消毒技术的研发评估以及相关法规标准的制修订提供关键的科学依据。准确理解和执行本标准操作规程对于获得可靠、可重复的试验结果至关重要。