白色念珠菌定量杀灭试验方法及应用
一、引言
白色念珠菌（Candida albicans）是一种广泛存在于人体及环境中的条件致病性酵母样真菌。在免疫力低下时，可引起皮肤粘膜感染（如鹅口疮、阴道炎）甚至危及生命的系统性感染。评估消毒剂、抗菌材料、物理方法等对白色念珠菌的杀灭效果，对于感染控制、医疗器械灭菌、公共卫生及抗真菌产品研发至关重要。定量杀灭试验（Quantitative Killing Assay）是评价该类杀灭效果的标准化、客观的金标准方法之一。
二、试验目的
本试验旨在通过严格的实验室程序，定量测定特定处理条件（如消毒剂、物理因子、抗菌剂等作用一定时间）前后，白色念珠菌活菌数量的变化，从而精确计算其杀灭对数值（Log Reduction Value, LRV）或杀灭率（Killing Rate, KR），客观评价该处理条件的抗真菌效力。
三、试验原理
- 菌悬液制备： 将处于对数生长期的白色念珠菌标准菌株，用适宜的稀释液（如含中和剂的磷酸盐缓冲液 PBS 或生理盐水）制备成一定浓度的均匀菌悬液。
- 试验组处理： 将菌悬液与待测样品（如稀释好的消毒剂）按特定比例混合，在预设温度下作用规定的时间。
- 对照组设置：
- 阳性对照组（菌液对照组）： 菌悬液 + 稀释液（不含待测样品），用于验证菌株活性及确定初始菌量。
- 中和剂对照组： （若使用中和剂）中和剂 + 菌悬液，验证中和剂本身及其对菌悬液的稀释作用不影响菌株存活，确保中和有效且无毒。
- 阴性对照组（无菌对照组）： 仅稀释液（或含中和剂的稀释液），用于排除污染。
- 中和作用： 作用时间结束后，立即加入足量且预先验证有效的中和剂（或采用稀释法、过滤法），迅速终止待测样品对菌体的持续作用。
- 活菌计数： 将经中和处理的试验组溶液、阳性对照组溶液进行一系列十倍梯度稀释。取适宜稀释度的稀释液，采用倾注平板法或涂布平板法接种于固体培养基（常用沙氏葡萄糖琼脂 SDA 或马铃薯葡萄糖琼脂 PDA）。在适宜温度（通常 28-32°C 或 35-37°C）下培养规定时间（通常 24-72 小时）。
- 菌落计数与计算：
- 计数平板上生长的典型白色念珠菌菌落形成单位（CFU）。
- 计算各样本的平均 CFU/mL。
- 杀灭对数值（LRV）计算： LRV = Log10 (阳性对照组平均CFU/mL) - Log10 (试验组平均CFU/mL)
- 杀灭率（KR）计算： KR (%) = [(阳性对照组平均CFU/mL - 试验组平均CFU/mL) / 阳性对照组平均CFU/mL] × 100%
四、材料与方法
- 菌株： 白色念珠菌（Candida albicans）标准菌株（如 ATCC 10231 或其它公认标准株）。
- 培养基：
- 复苏与传代： 沙氏葡萄糖肉汤（SDB）或马铃薯葡萄糖肉汤（PDB）。
- 平板计数： 沙氏葡萄糖琼脂（SDA）或马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）。
- 稀释液： 含适宜中和剂的磷酸盐缓冲液（PBS, pH 7.2-7.4）或生理盐水。（关键：中和剂种类及浓度需根据待测样品性质预先进行有效性、无菌性、毒性验证）。
- 中和剂： 根据待测样品活性成分选择（如硫代硫酸钠用于含氯/碘消毒剂，卵磷脂吐温80用于季铵盐类、酚类、洗必泰等，甘氨酸用于醛类等）。其有效性必须验证。
- 主要仪器： 恒温培养箱、恒温水浴锅（或特定温度环境）、生物安全柜、涡旋振荡器、移液器及无菌吸头、无菌平皿、无菌试管、菌落计数器（或自动计数仪）。
- 待测样品： 按照产品说明书或研究方案进行稀释或制备。
五、试验步骤
- 菌种活化与培养：
- 从冻存管或斜面取白色念珠菌标准株，接种于 SDB/PDB 中。
- 在适宜温度（如 30°C 或 35°C）下震荡培养 18-24 小时（或至对数生长期）。
- 菌悬液制备：
- 取适量新鲜培养物，用无菌 PBS 或生理盐水洗涤离心（去除培养基残留），重复 2-3 次。
- 用含中和剂的稀释液将菌体重悬，调整浓度至目标浓度范围（通常 1×10^7 ~ 5×10^7 CFU/mL），作为试验用菌悬液。
- 试验体系建立：
- 试验组： 无菌试管中，按比例（如 1:9）加入预先保温至测试温度的待测样品和菌悬液，迅速混匀并开始计时。
- 阳性对照组： 无菌试管中，按相同比例加入含中和剂的稀释液和菌悬液，混匀。
- 中和剂对照组： 无菌试管中，加入中和剂（或含中和剂的稀释液）和菌悬液，混匀。
- 阴性对照组： 无菌试管中，仅加入含中和剂的稀释液。
- 作用与中和：
- 将各组试管置于预设温度（如 20°C 或特定温度）水浴中。
- 作用至预定时间（如 1 min, 5 min, 10 min, 30 min）后，立即向试验组和中和剂对照组试管中加入足量、预先验证有效的中和剂（若试验组初始稀释液中已含中和剂且浓度足够，可省略此步；否则采用稀释法）。充分混匀终止反应。
- 阳性对照组也同步加入等量中和剂（或稀释液）混匀。
- 稀释与接种：
- 作用结束后，尽快将试验组、阳性对照组、中和剂对照组进行十倍梯度稀释（如 10^0, 10^{-1}, 10^{-2} ...）。
- 选取 2-3 个预期能长出 30-300 个菌落的稀释度，分别取 1.0 mL 至无菌平皿中（倾注法），或取 0.1 mL 涂布于已凝固的平板上（涂布法）。
- 阴性对照组取最高稀释度或原液 1.0 mL 倾注或 0.1 mL 涂布。
- 培养与计数：
- 倾注法待琼脂凝固后，涂布法待液体吸收后，将平板倒置于适宜温度（通常 30-35°C）培养箱中培养 24-72 小时。
- 培养结束后，计数各平板上的典型白色念珠菌菌落数。阴性对照组应无菌生长。
- 数据处理：
- 计算各样本同一稀释度平行平板的平均 CFU。
- 根据稀释度计算各组原液的平均 CFU/mL。
- 按前述公式计算 LRV 和/或 KR。
- 试验应包含至少三次独立的重复。
六、结果判定与报告
- 有效性验证：
- 阳性对照组活菌浓度应在目标范围内（如 ≥1×10^6 CFU/mL），证明菌株状态良好。
- 中和剂对照组回收菌量应不低于阳性对照组的 80%（通常要求 >50%），且与阳性对照组无统计学显著差异（p>0.05），证明中和有效且无毒性。
- 阴性对照组应无菌生长。
- 杀灭效果评价：
- 报告各作用时间点的平均 LRV 和/或 KR。LRV ≥ 3.0（即杀灭率 ≥ 99.9%）通常被认为具有良好的杀灭效果。具体合格标准需依据相关法规、标准（如消毒技术规范、药典）或研究目的设定。
- 可绘制不同作用时间下的杀灭曲线（LRV/KR vs Time）。
- 报告内容： 试验名称、菌株信息、待测样品描述、作用浓度（或强度）、作用温度、作用时间、中和剂信息、试验方法关键参数、各组 CFU/mL 数据、计算所得的 LRV 和/或 KR、结果判定结论、试验日期、操作者签名等。
七、注意事项
- 中和剂验证： 这是试验成功的关键前提，必须提前完成且有效。
- 菌悬液状态： 使用对数生长期菌悬液，保证活力和均一性。浓度需准确控制。
- 作用时间点： 精确计时，加入中和剂或稀释动作要迅速一致。
- 温度控制： 作用温度需恒定，尤其是温度敏感型样品。
- 稀释接种： 梯度稀释操作要规范准确，防止交叉污染。选择合适稀释度保证菌落计数在有效范围内。
- 无菌操作： 全过程在生物安全柜中进行，严格无菌操作。
- 重复性： 进行多次独立重复试验以增加结果可信度。
- 标准化： 遵循相关国家标准、行业标准或国际标准（如 AOAC, EN, ASTM 等）进行操作。
八、应用意义
白色念珠菌定量杀灭试验为以下领域提供关键的科学依据：
- 消毒产品注册与评价： 验证消毒剂对真菌的杀灭效果是否符合法规要求。
- 医疗器械灭菌/高水平消毒： 评估灭菌过程或高水平消毒剂对真菌孢子的杀灭能力。
- 抗菌材料研发： 评价涂层、织物、塑料等材料的抗真菌性能。
- 天然产物筛选： 从植物、微生物等来源中筛选具有抗白色念珠菌活性的成分。
- 物理消毒方法研究： 评估紫外线、臭氧、等离子体等物理手段对白色念珠菌的杀灭效果。
- 医院感染控制策略制定： 为环境表面消毒、手卫生等提供效果数据支持。
结论
白色念珠菌定量杀灭试验是一种严谨、客观的实验室评估方法，通过定量测定处理前后活菌数量的变化，能够准确反映消毒剂、抗菌剂或物理因子对该重要条件致病真菌的杀灭效能。规范的操作、严格的对照设置（特别是有效的中和验证）以及精确的数据处理，是保证试验结果科学可靠、具有可比性和实际应用价值的基础。该试验在保障公共卫生安全、控制医院感染、研发新型抗真菌产品等方面发挥着不可替代的作用。