枯草杆菌芽孢定性杀灭试验
一、 引言
验证消毒与灭菌方法的有效性对于保障公共卫生、食品安全、医疗安全和生物安全至关重要。枯草杆菌黑色变种（Bacillus atrophaeus ATCC 9372）芽孢因其极强的耐受性（尤其耐热、耐化学消毒剂），被广泛用作评价灭菌过程和化学消毒剂杀菌效果的生物指示剂。本定性杀灭试验旨在通过观察处理组芽孢是否完全被杀灭（无生长），初步评估某种特定消毒或灭菌程序对高抗力微生物的杀灭能力。
二、 试验原理
本试验基于微生物学培养原理：
- 指示微生物： 使用已知浓度、经过标准培养和纯化的枯草杆菌芽孢悬液。
- 处理过程： 将芽孢悬液暴露于待测的消毒或灭菌条件下（如特定温度、压力、化学消毒剂浓度与作用时间）。
- 中和终止： 作用时间结束后，立即加入合适的中和剂以终止消毒剂的持续作用（若使用化学消毒剂），并确保中和剂对微生物无毒且有效。
- 培养观察： 将处理后的样本（含中和剂）接种到营养琼脂培养基上，在适宜条件下培养。
- 结果判定： 在规定培养时间后，通过观察培养基上是否有枯草杆菌菌落生长（可见的黑色或深棕色菌落）来判断芽孢是否完全被杀灭：
- 无生长（阴性）： 表明该处理条件在本次试验中实现了对所用枯草杆菌芽孢的定性杀灭。
- 有生长（阳性）： 表明该处理条件未能完全杀灭所有芽孢，未达到定性杀灭要求。
- 对照设置： 必须设置严格的阳性和阴性对照以保证试验结果的有效性和可靠性。
三、 材料与仪器
- 指示微生物： 枯草杆菌黑色变种（Bacillus atrophaeus）ATCC 9372 芽孢悬液（建议使用商品化、浓度标定的标准品，或实验室自行制备并标定）。
- 培养基：
- 胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA）或营养琼脂培养基（NA）。
- 胰酪大豆胨液体培养基（TSB）或营养肉汤培养基（NB）。
- （可选）用于芽孢生成和纯化的特殊培养基（如高浓度MnSO4培养基）。
- 试剂：
- 消毒灭菌剂： 待测试的消毒剂或灭菌介质（如过氧乙酸、戊二醛、环氧乙烷、蒸汽等）。
- 中和剂： 针对所用消毒剂选择的、预先验证过有效性和无毒性的中和剂（如硫代硫酸钠用于含氯/含碘消毒剂，卵磷脂-吐温80用于季铵盐类、醇类、酚类等）。
- 稀释液： 磷酸盐缓冲液（PBS, pH 7.2 ± 0.2）或生理盐水（0.85~0.9% NaCl）。
- 75%乙醇（用于消毒）。
- 仪器设备：
- 恒温培养箱（30-35°C）。
- 恒温水浴箱/干烤箱/灭菌器（提供所需的温度条件）。
- 生物安全柜（II级）。
- 高压蒸汽灭菌器（用于培养基、器械灭菌）。
- 涡旋振荡器。
- 移液器（1mL, 10mL）及无菌吸头。
- 无菌试管、平皿（90mm）、刻度吸管、三角瓶。
- 无菌镊子、涂布棒或L棒。
- 菌落计数器（可选）。
- （若需）pH计。
- 其他： 计时器、标记笔、生物危害废弃物袋。
四、 试验方法
- 芽孢悬液准备（若使用自制悬液）：
- 复苏冻存的枯草杆菌黑色变种菌株，划线接种于TSA/NA平板，30-35°C培养24-48小时。
- 挑取典型单菌落接种于TSB/NB液体培养基中，30-35°C振荡培养至对数生长期。
- 将适量菌液涂布或倾注于芽孢形成培养基（如含50mg/L MnSO4的琼脂平板）。
- 30-35°C培养5-7天（或直至90%以上形成芽孢）。
- 使用无菌PBS或生理盐水洗脱平板上的芽孢。
- 70°C水浴加热30分钟灭活残留的营养体细胞。
- 离心洗涤数次（如3000rpm, 15min），重悬于含适量保护剂（如40%甘油）的PBS中。
- 用血球计数板或平板活菌计数法标定芽孢悬液浓度（通常在10⁶ - 10⁹ CFU/mL范围）。低温（如4°C）储存备用。
- 试验分组：
- 试验组： 芽孢悬液 + 消毒灭菌剂 + 中和剂 + 培养。
- 阳性对照组： 芽孢悬液 + 稀释液（代替消毒剂） + 中和剂 + 培养（应生长）。
- 阴性对照组：
- 培养基无菌对照： 未接种的培养基培养（应不长）。
- 稀释液无菌对照： 稀释液 + 中和剂 + 培养（应不长）。
- 中和剂无菌及有效性对照（关键）： 中和剂 + 培养（应不长），以及（消毒剂+中和剂）混合液培养（应不长）。
- 试验操作：
- 在无菌条件下，于无菌试管中加入一定体积（如0.1mL）的枯草杆菌芽孢悬液（浓度需保证阳性对照最终能生长出足够菌落）。
- 试验组： 迅速加入规定体积（如9.9mL）的待测消毒剂（浓度应为使用浓度），立即混匀并开始计时。确保消毒剂与芽孢充分接触（通常为静止接触）。
- 阳性对照组： 加入等量无菌稀释液代替消毒剂。
- 在设定温度（如室温20-25°C，或在恒温水浴箱/特定设备中进行）下作用规定的时间（t）。
- 作用时间（t）结束后：
- 立即向试验组试管中加入规定体积（如10mL）的预冷（推荐4°C）中和剂，充分混匀（涡旋振荡），中和作用至少10分钟。
- 立即向阳性对照组试管中加入等体积中和剂，混匀。
- 中和后样本接种：
- 分别从试验组和阳性对照组的中和后混合液中吸取一定体积（如1.0mL或适量稀释液），加入到无菌平皿中（做平行样，一般至少2个平皿/组）。
- 倾注冷却至约45-50°C的TSA或NA培养基约15-20mL，轻轻旋转平皿混匀。
- （或）采用涂布法：吸取0.1-0.5mL混合液至已凝固的平板上，用无菌L棒均匀涂布。
- 阴性对照组： 按分组设置，分别取相应试剂（无菌稀释液、中和剂、消毒剂+中和剂）加入平皿，倾注培养基或涂布。
- 待琼脂凝固后，将所有平皿倒置放入30-35°C恒温培养箱中培养。
- 培养时间：通常为48-72小时（枯草杆菌生长较快，建议48小时初步观察，72小时最终判定）。
- 观察与记录：
- 每天观察平皿生长情况，重点注意72小时的结果。
- 记录各平皿的菌落生长情况（有/无）、菌落形态特征（枯草杆菌通常为不透明、干燥、白色至奶油色，但黑色变种ATCC 9372在含酪蛋白水解物培养基上可形成典型的棕色至黑色菌落）。
- 拍摄代表性平皿照片（如有条件）。
五、 结果判定
- 阴性对照组： 所有平皿必须无菌落生长。若生长，则试验无效，需检查污染来源并重做。
- 中和剂与有效性对照：
- 中和剂无菌对照平皿应无菌落生长。
- （消毒剂+中和剂）混合液平皿应无菌落生长。若生长，说明中和剂无效或中和不彻底，试验结果无效。
- 阳性对照组： 所有平皿必须有典型的枯草杆菌菌落（特别是黑色/棕色特征）生长，且菌落数应足以证明初始芽孢是存活的。若未生长，说明芽孢悬液失活或操作错误，试验无效。
- 试验组： 在满足以上所有对照要求的前提下：
- 定性杀灭判定标准：
- 若所有平行试验组平皿（培养72小时后）均无菌落生长，判为“通过”定性杀灭试验，表明该消毒/灭菌条件在本次试验中完全杀灭了所用浓度的枯草杆菌芽孢。
- 若任何一个平行试验组平皿出现菌落生长（即使只有1个菌落），判为“未通过”定性杀灭试验，表明该条件未能完全杀灭所有芽孢。
- 定性杀灭判定标准：
六、 关键控制点与注意事项
- 芽孢活力与浓度： 确保使用的芽孢悬液活力强、浓度准确且稳定。每次试验前最好验证活力（阳性对照必须有效）。使用商品化标准品可提高结果可靠性和可比性。
- 中和剂验证： 这是试验成功的关键！ 必须对选用的中和剂进行预验证，确保其能迅速、完全地中和消毒剂的残留活性，且本身对微生物无毒、不影响后续培养。中和剂选择不当是常见错误来源。
- 接触条件： 严格控制消毒剂的浓度、作用温度和作用时间。混合要迅速均匀。对于固体载体上的芽孢（如载体定性试验），确保消毒剂能充分接触所有表面。
- 及时中和： 作用时间一到，必须立即加入中和剂并充分混匀，以准确停止消毒作用。
- 无菌操作： 所有步骤必须在无菌条件下进行（主要在生物安全柜内），避免杂菌污染导致的假阳性结果。
- 培养条件： 培养温度和时间需严格按照规范，确保枯草杆菌能充分生长显现。
- 生物安全： 枯草杆菌为生物安全一级（BSL-1），但仍需遵循良好的微生物学操作规范（GMP），在生物安全柜内操作活菌和芽孢悬液，废弃物需经有效灭菌处理。
- 定性性质： 本试验为“定性”（pass/fail），仅能判断处理组芽孢是否被完全杀灭（无生长），不能提供杀灭效率的具体数值（如杀灭对数值Log Reduction）。如需定量结果，应进行定量杀灭试验。
七、 结论
枯草杆菌芽孢定性杀灭试验是一种重要的微生物学检测方法，主要用于初步评估和验证消毒或灭菌程序对高抗力微生物指标的杀灭能力。通过严格设置对照组（特别是中和剂验证和阳性对照）、规范操作流程并准确判定结果，该试验可为消毒灭菌产品的效果评价、灭菌过程的验证以及消毒灭菌规范的制定提供关键的科学依据。试验结果“通过”表明在该特定条件下，芽孢被完全杀灭；“未通过”则提示该方法未能达到预期效果，需要改进或重新评估。