其他细菌（面）定量定

其他细菌（面条制品）定量检测指南

一、 定义与意义

“其他细菌”定量检测，在面条制品（包括但不限于干面、鲜面、方便面面饼等）的质量控制中，通常指需氧菌总数（Aerobic Plate Count, APC） 的测定。该指标反映了样品中在需氧条件下、特定培养基上、特定温度下生长繁殖的活菌总数（包括细菌和酵母菌），是评估面条制品微生物卫生状况、加工环境卫生控制水平、保质期预测及潜在腐败风险的关键通用性指示指标。

二、 检测原理

采用标准平板计数法。将代表性样品经过适当的稀释处理后，接种于营养琼脂培养基上，在规定的温度和时间内进行培养。每个活的微生物细胞（或孢子、菌团）理论上能在培养基上生长形成一个肉眼可见的菌落。通过计数平板上生长的菌落数（菌落形成单位，CFU），结合稀释倍数和接种量，计算出每克（或每毫升、每平方厘米）样品中所含的需氧菌总数。

三、 主要仪器与试剂

1. 仪器设备：
   • 无菌均质器或无菌研钵与研杵
   • 恒温培养箱（通常设定为 36±1℃）
   • 恒温水浴锅（45±1℃）
   • 无菌吸管（1mL, 10mL）或微量移液器及无菌吸头
   • 无菌培养皿（直径90mm）
   • 无菌锥形瓶（带玻璃珠，250mL或500mL）
   • 无菌稀释瓶（100mL，带刻度）
   • 精密天平（感量0.1g）
   • pH计
   • 菌落计数器或放大镜镜检设备
   • 高压蒸汽灭菌锅
   • 冰箱（2-8℃）
   • 超净工作台或生物安全柜（推荐）
2. 培养基与试剂：
   • 平板计数琼脂（Plate Count Agar, PCA）或营养琼脂（Nutrient Agar, NA）
   • 磷酸盐缓冲稀释液（0.1mol/L PBS, pH 7.2±0.2）或生理盐水（0.85-0.90% NaCl）（需灭菌）
   • 75%乙醇（用于消毒）
   • 无菌蒸馏水

四、 操作步骤

1. 样品制备与无菌操作：

   • 实验前开启超净工作台紫外灭菌至少30分钟，使用前用75%乙醇擦拭台面及所有即将使用的仪器手柄等。
   • 操作人员需严格进行手部消毒，穿戴洁净实验服、口罩、帽子。
   • 所有玻璃器皿、培养基、稀释液、吸管、培养皿等均需经121℃高压蒸汽灭菌至少15分钟。

2. 样品处理与均质：

   • 在无菌条件下称取25g（精确至0.1g）面条样品（若为面饼，需无菌碾碎成小颗粒）。
   • 将样品放入装有225mL预热至45±1℃无菌磷酸盐缓冲液（或生理盐水）的无菌均质袋（或无菌锥形瓶，内含适量无菌玻璃珠）中。
   • 使用拍击式均质器（8000-10000 rpm）均质1-2分钟，或用手（或振荡器）剧烈振荡锥形瓶（≥80次，≥30秒），制成1:10的初始稀释液（10⁻¹）。确保样品充分分散均匀。

3. 系列稀释：

   • 用1mL无菌吸管吸取1mL 10⁻¹稀释液，沿管壁缓慢注入盛有9mL无菌稀释液的试管（或稀释瓶）中，轻轻吹吸数次或涡旋混合均匀（避免产生气泡），制成10⁻²稀释液。
   • 更换新的无菌吸管，同上操作，依次制备10⁻³、10⁻⁴、10⁻⁵等连续的十倍梯度稀释液（根据样品预期污染程度选择适当的稀释梯度，通常面条制品选择10⁻¹至10⁻⁴或10⁻⁵）。

4. 倾注平板：

   • 选择2-3个适宜的连续稀释度（通常选择培养后能长出30-300个CFU的稀释度），每个稀释度做两个平行（即两个平板）。
   • 用无菌吸管吸取1mL选定稀释度的稀释液，分别注入两个无菌培养皿底部中央。
   • 提前将融化的平板计数琼脂培养基冷却并恒温至45±1℃（水浴锅保温）。迅速向每个培养皿中倾注约15-20mL培养基（确保完全覆盖皿底）。
   • 立即轻轻水平旋转培养皿，使稀释液与培养基充分混匀（避免溅起），静置待其凝固。

5. 培养：

   • 待琼脂完全凝固后，将培养皿倒置（防止冷凝水滴落影响菌落生长和计数），放入恒温培养箱中。
   • 在36±1℃下培养48±2小时（具体时间依据所采用的标准流程要求）。培养过程中避免移动或振动培养箱。

6. 菌落计数：

   • 培养结束后，立即取出平板计数（避免菌落蔓延影响结果）。选择菌落数在30-300 CFU之间的平板进行计数。
   • 使用菌落计数器或在良好光线下肉眼观察。对于紧密相连但可分辨的菌落应分别计数。若出现片状蔓延菌落，该平板应舍弃；若片状菌落不超过一半，另一半分布均匀菌落可计数。细小不易辨别的菌落可借助放大镜。
   • 记录每个平板的菌落数。

五、 结果计算与报告

1. 计算：

   • 若只有一个适宜稀释度（两个平行平板菌落数均在30-300 CFU之间），计算两个平板菌落数的平均值（N）。
   • 若有连续两个适宜稀释度，且低稀释度平板菌落数均在30-300 CFU之间，则计算每个稀释度两平行平板的平均值（N1, N2）。
   • 样品中需氧菌总数（CFU/g）计算公式如下：
     • 单个适宜稀释度： 需氧菌总数 (CFU/g) = N × D
     • 连续两个适宜稀释度： 需氧菌总数 (CFU/g) = (N1 × D1 + N2 × D2) / 2 (其中D1, D2分别为对应的稀释倍数)。若两个稀释度的结果差异显著（如一个稀释度平均值大于另一个的2倍），需检查原因或报告范围。
     • 式中：
       • N (或 N1, N2)：相应稀释度下计数平板的平均菌落数。
       • D (或 D1, D2)：相应稀释液的稀释倍数（如10⁻²稀释度为100，10⁻³为1000）。
       • 若接种量为1mL，计算结果单位即为CFU/g（或CFU/mL）。

2. 报告：

   • 报告每克样品中需氧菌总数的估计值。
   • 若所有平板菌落数均小于30，则报告实际计算结果（如 < 30 × 最低稀释倍数）。
   • 若最低稀释度平均菌落数小于30，报告为“< 30 × 稀释倍数”CFU/g。
   • 若最高稀释度平均菌落数大于300，报告为“> 300 × 稀释倍数”CFU/g。
   • 结果取两位有效数字（如1.2 × 10⁴ CFU/g）。
   • 明确标注检测方法依据（如参照食品安全国家标准GB 4789.2，或ISO 4833-1等）。
   • 报告需清晰注明样品名称、批号、检测日期等信息。

六、 质量控制要点

1. 无菌操作： 整个实验过程的核心，贯穿样品处理、稀释、接种、倾注等环节，防止外源性污染。
2. 稀释均匀性： 每一步稀释必须确保充分混匀，吸液位置应位于液面下适当深度。
3. 培养基与温度： 培养基质量符合要求，倾注前务必冷却至45±1℃，防止烫死微生物或造成冷凝水过多。培养温度和时间严格控制。
4. 平行与稀释梯度： 每个稀释度做两个平行板，选择合适的稀释梯度以确保有平板落在有效计数范围（30-300 CFU）。
5. 计数准确性： 准确识别和计数菌落，特别是接近30或300界限时。记录所有平行板的原始数据。
6. 试剂空白与培养基空白：
   • 试剂空白： 用1mL无菌稀释液代替样品液进行倾注平板，培养后应无菌生长（0 CFU）。
   • 培养基空白： 倾注一个未接种任何稀释液的无菌平板（仅含培养基），培养后应无菌生长（0 CFU）。如有菌生长，则本次试验所用培养基可能污染，结果无效。
7. 阳性对照（可选）： 使用已知活菌浓度的标准菌株（如大肠埃希氏菌ATCC 25922或枯草芽孢杆菌ATCC 6633）进行同步实验，验证培养条件和方法的可靠性。
8. 实验室环境监控： 定期对超净工作台/生物安全柜进行沉降菌检测。

七、 注意事项

1. 样品代表性： 取样需遵循随机原则，确保样品能代表整批产品。
2. 及时处理： 样品送达实验室后应尽快检测。如需冷藏，检测前需恢复到室温。
3. 均质充分： 确保样品在稀释液中充分分散成均一悬液，这对结果准确性至关重要。
4. 稀释精度： 吸管需校准，吸液量务必准确。每次稀释更换无菌吸管。
5. 培养基融化与冷却： 融化后的培养基避免反复加热融化。冷却温度过高会烫死微生物，过低则易凝固导致混合不均。
6. 平板标记： 在皿底外侧清晰标记样品编号、稀释度、日期及操作者等信息。
7. 培养皿堆叠： 培养时培养皿堆叠层数不宜过多（通常不超过6层），确保箱内空气流通和温度均匀。
8. 结果解读： 需氧菌总数是一个卫生指示指标，其数值高低与产品卫生状况、腐败风险相关，但不直接等同于致病菌污染。超标结果需结合其他微生物指标（如大肠菌群、致病菌）及生产工艺进行综合分析和溯源。

结论

面条制品中“其他细菌”（需氧菌总数）的定量检测是保障食品安全与品质的重要手段。通过严格执行标准化的操作流程（样品处理、梯度稀释、倾注培养、准确计数），严格控制无菌操作和各项关键参数（温度、时间、稀释均匀性），并实施有效的实验室内部质量控制（空白对照、环境监控），可以获得可靠的定量结果。该结果对于生产企业监控卫生状况、评估保质期、指导工艺改进，以及监管部门进行市场抽检和风险监测，都具有重要的实践意义。