幽门螺旋杆菌定量杀灭试验

发布时间：2025-07-01 10:53:46 阅读量：6 作者：生物检测中心

幽门螺旋杆菌定量杀灭试验：原理、方法与应用

一、 引言

幽门螺旋杆菌（Helicobacter pylori, Hp）是一种定植于人类胃黏膜的革兰氏阴性微需氧螺旋杆菌，是慢性活动性胃炎、消化性溃疡、胃黏膜相关淋巴组织（MALT）淋巴瘤的主要致病因子，同时也是胃癌的重要风险因素。由于其高感染率（全球约50%）及相关疾病的严重性，幽门螺旋杆菌的根除治疗至关重要。

然而，随着抗生素的广泛应用，幽门螺旋杆菌的耐药性问题日益突出，导致标准三联疗法的根除率在全球范围内显著下降。因此，准确评估抗生素或其他杀菌剂对幽门螺旋杆菌的体外杀菌效果，对于指导临床用药、研发新疗法以及评估消毒产品的效能具有重要意义。幽门螺旋杆菌定量杀灭试验（Quantitative Killing Assay for Helicobacter pylori）正是为此目的而设计的标准化体外实验方法。

二、 试验原理

定量杀灭试验的核心原理是：将特定浓度的待测杀菌物质（如抗生素、抗菌肽、植物提取物、消毒剂等）与已知数量的、处于对数生长期的幽门螺旋杆菌活菌在适宜的培养条件下共孵育一定时间。孵育结束后，通过特定的方法终止杀菌作用，并对存活菌进行定量培养计数。通过比较处理组与未处理对照组（仅含细菌和培养基/缓冲液）的活菌数量，精确计算出杀菌物质在特定浓度和作用时间下对细菌的杀灭率（Killing Rate, KR）或杀菌对数值（Log Reduction）。

  • 杀灭率 (KR%) = [(对照组活菌数 - 处理组活菌数) / 对照组活菌数] × 100%
  • 杀菌对数值 (Log Reduction) = Log₁₀ (对照组活菌数) - Log₁₀ (处理组活菌数)
 

例如，一个3 Log的减少意味着存活菌数下降到初始菌数的千分之一（10⁻³），杀灭率为99.9%。

三、 试验材料与方法

  1. 菌株：

    • 通常选用标准的幽门螺旋杆菌参考菌株（如ATCC 43504）或具有代表性的临床分离株。临床分离株更能反映当前流行菌株的特性（尤其耐药性）。
    • 菌株应在-80°C甘油冻存管或液氮中长期保存。试验前复苏，接种于适宜的固体培养基（如含5-10%脱纤维羊血或马血的哥伦比亚琼脂、脑心浸液琼脂等）上。
    • 培养条件：微需氧环境（通常为85% N₂, 10% CO₂, 5% O₂），37°C，高湿度，培养3-5天至菌落生长良好。

  2. 杀菌物质：

    • 待测样品： 明确标注名称、来源（如化合物、提取物等）、溶剂、初始浓度/效价。需无菌处理或过滤除菌。
    • 溶剂对照： 如果待测样品溶解于某种溶剂（如DMSO、乙醇），需设置仅含该溶剂（在测试体系中的最高终浓度）的对照，以排除溶剂本身对细菌生长的影响。
    • 阳性对照： 通常选用已知对Hp有效的标准抗生素（如阿莫西林、克拉霉素、甲硝唑、左氧氟沙星、四环素等），用于验证试验系统的可靠性。
    • 阴性对照 (培养基/缓冲液对照)： 仅含细菌和培养基或缓冲液，用于测定接种菌的初始活菌数和最大生长潜力。

  3. 培养基与试剂：

    • 液体培养基： 常用的有布氏肉汤(Brucella Broth)、脑心浸液(BHI)肉汤，通常需补充5-10%胎牛血清(FBS)或马血清、以及适当的生长因子补充剂（如Isovitalex或类似物）。
    • 固体培养基： 含血的哥伦比亚琼脂、BHI琼脂等，用于菌落计数。
    • 磷酸盐缓冲液 (PBS)： 用于洗涤和稀释细菌。
    • 中和剂 (如适用)： 当测试化学消毒剂或抗菌剂时，孵育结束后需加入合适的中和剂（如卵磷脂、吐温80、硫代硫酸钠等及其组合物）以立即终止其杀菌作用，防止残留活性影响后续培养计数。中和剂的选择和有效性必须经过预先验证（中和剂鉴定试验）。

  4. 主要仪器与耗材：

    • 微需氧培养系统（微需氧产气袋/罐或专业培养箱）
    • 恒温摇床（37°C）
    • 恒温培养箱（37°C）
    • 生物安全柜
    • 离心机
    • 涡旋振荡器
    • 水浴锅（37°C）
    • 移液器及无菌枪头
    • 无菌试管、离心管
    • 无菌培养皿
    • 菌落计数器（手动或自动）

  5. 试验步骤：

    • 菌悬液制备：
      • 从新鲜培养（3-5天）的平板上挑取典型菌落，悬浮于适量含血清的液体培养基或PBS中。
      • 调整菌悬液浓度至约10⁸ CFU/mL（0.5 McFarland浊度标准或使用分光光度计测定OD值校准）。此为初始工作菌悬液。
      • 必要时，用液体培养基将工作菌悬液稀释至试验所需的起始浓度（通常为10⁶ CFU/mL或10⁵ CFU/mL）。
    • 暴露处理：
      • 在无菌试管（或96孔板）中，加入一定体积的待测杀菌物质溶液（浓度应至少为最终测试浓度的2倍）。
      • 加入等体积的上述菌悬液（含菌量通常为10⁶ CFU/mL），混匀。此时，体系中杀菌物质的浓度即为测试浓度，菌浓度约为5×10⁵ CFU/mL。同时设置溶剂对照、阳性对照和阴性对照。
      • 将混合液置于37°C恒温摇床中孵育（振荡速度约100-150 rpm），或在微需氧环境下静置培养。作用时间根据试验目的设定（如15min, 30min, 1h, 2h, 4h, 24h等）。
    • 终止杀菌作用与活菌计数：
      • 即时计数法： 对于作用时间较短（如消毒剂测试），到达预定时间点后，立即吸取混合液，用含有合适中和剂的冷PBS或液体培养基进行系列梯度稀释（如10倍梯度稀释）。若测试抗生素且无需立即中和，也可直接稀释。
      • 培养后计数法： 对于作用时间较长（如数小时至24小时的抗生素药效动力学研究），到达预定时间点后，可先离心收集菌体，弃上清（含杀菌物质），用无菌PBS或液体培养基洗涤菌体1-2次（尽可能去除残留杀菌物质），再重悬于新鲜液体培养基或PBS中进行系列梯度稀释。
      • 选择合适的稀释度（通常使平板上长出30-300 CFU），吸取一定体积（如0.1 mL）的稀释液，均匀涂布于固体培养基平板上。每个稀释度做2-3个重复平板。
      • 将平板倒置，置于微需氧环境下，37°C培养3-7天。
    • 菌落计数：
      • 培养结束后，对平板上的菌落进行计数。选择菌落数在30-300之间的平板进行计数。
      • 计算各组的平均菌落数（CFU/mL）。需乘以稀释倍数和涂布体积的倒数（如涂布0.1mL，则乘以10），得到原始混合液中的活菌浓度（CFU/mL）。
    • 结果计算与分析：
      • 分别计算处理组、溶剂对照组、阳性对照组和阴性对照组（0时或未处理）的活菌数（CFU/mL）。
      • 计算每个处理组相对于阴性对照组（生长对照组）的杀灭率（KR%）和/或杀菌对数值（Log Reduction）。
      • 可绘制杀菌曲线（活菌数或Log Reduction vs. 时间）来直观反映杀菌动力学过程。
      • 计算关键指标：
        • 最低杀菌浓度 (MBC)： 通常定义为在体外条件下，能使≥99.9% (3 Log) 的初始接种菌被杀灭的最低杀菌物质浓度。需结合不同浓度下的杀菌结果确定。
        • 杀菌速率常数： 通过拟合杀菌曲线（活菌数随时间呈指数下降阶段），可计算杀菌速率常数K，反映杀菌速度的快慢。
 

四、 关键注意事项

  1. 质量控制：
    • 菌株活力： 必须使用处于对数生长期、活力旺盛的菌株。传代次数不宜过多。
    • 接种菌量： 起始接种浓度直接影响结果判定（如MBC），需精确控制。
    • 中和剂验证： 对于化学杀菌剂，必须预先验证所选中和剂能有效中和其杀菌活性，且中和剂本身无毒、不影响细菌复苏和生长。
    • 无菌操作： 整个试验过程需严格无菌操作，避免污染。
    • 重复性： 试验应设置合理的生物学重复和技术重复。
    • 培养基和血清： 不同批次培养基和血清可能影响结果，需尽量使用同一批次或验证一致性。
  2. 微需氧环境： 幽门螺旋杆菌对氧气极其敏感。除暴露处理阶段在液体环境中短暂进行外，细菌的复苏、传代、平板涂布和培养计数均需在严格的微需氧环境下进行，否则会导致细菌死亡或生长不良，影响结果准确性。
  3. 孵育条件： 孵育温度和时间需精确控制。
  4. 结果判读： 菌落计数需准确。幽门螺旋杆菌菌落通常细小、透明或半透明，需仔细辨认。培养时间要足够（通常不少于3天）。
 

五、 应用领域

  1. 抗生素药敏试验与耐药性研究： 评估现有抗生素对临床分离株的体外杀菌活性（MBC测定），研究耐药机制，指导临床个体化用药方案制定（尤其对于多重耐药菌）。
  2. 新型抗菌药物/疗法研发： 筛选具有抗幽门螺旋杆菌活性的新化合物、天然产物、抗菌肽、噬菌体疗法等，评估其杀菌效力、杀菌动力学特征（时间-杀菌曲线）和潜在杀菌浓度。
  3. 联合用药评价： 研究不同抗生素组合或其他抗菌剂之间的协同、相加、无关或拮抗作用，为寻找更有效的联合根除方案提供实验依据。
  4. 消毒剂效能评估： 评价医疗器械消毒剂、环境消毒剂、口腔卫生用品（如漱口水）等对幽门螺旋杆菌标准株或临床株的杀灭效果，验证其是否能达到规定的消毒标准（如99.999%杀灭率，即5 Log Reduction）。
  5. 基础研究： 研究幽门螺旋杆菌对不同环境压力（如酸、氧化应激）的耐受性差异，探究其致病机制和生存策略。
 

六、 优点与局限性

  • 优点：
    • 提供定量的杀菌效果数据（杀灭率、Log Reduction、MBC），结果客观、可比性强。
    • 能详细描绘杀菌动力学过程（时间-杀菌曲线）。
    • 方法相对标准化，可应用于多种类型的杀菌物质评价。
    • 是评估杀菌效力（如消毒剂）和新药研发的关键体外筛选工具。
  • 局限性：
    • 是体外试验，其结果不能完全等同于体内的抗菌或治疗效果。体内环境复杂（胃酸、黏液层、免疫因素、药物代谢动力学/药效动力学等），会影响药物作用的发挥。
    • 操作相对复杂，耗时长（尤其是培养计数步骤），技术要求高（需严格微需氧条件）。
    • 难以模拟细菌在体内形成的生物膜状态，而生物膜中的细菌对抗菌剂的耐受性显著增强。
    • 结果可能受实验条件（如培养基成分、血清浓度、接种量）的影响。
 

七、 结论

幽门螺旋杆菌定量杀灭试验是评估杀菌物质（包括抗生素、新型抗菌剂、消毒剂等）体外抗幽门螺旋杆菌活性的核心实验方法。通过标准化的操作流程和严格的质量控制，该试验能够提供精确的定量数据（如杀灭率、Log Reduction、MBC）和杀菌动力学信息，在指导临床用药、研发新型抗Hp药物、评估消毒产品效能以及进行相关基础研究中发挥着不可替代的作用。尽管存在体外试验的固有局限性，但其结果仍为后续的体内实验和临床应用提供了重要的初步筛选依据和理论支持。理解其原理、熟练掌握方法、并注意关键影响因素，对于获得可靠、可重复的实验结果至关重要。随着耐药问题的加剧和新疗法的探索，该试验的应用价值将持续凸显。