金黄色葡萄球菌定量杀灭试验方法
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是广泛存在于环境中且具有较强致病力的革兰氏阳性球菌，常作为评价消毒剂、抗菌材料或物理杀菌方法效果的指示微生物。定量杀灭试验是评估受试物对该菌杀灭（灭活）效力的标准化方法。
一、试验原理
定量杀灭试验通过精确比较受试物处理组与未经处理的对照组中存活的金黄色葡萄球菌数量，计算杀灭对数值（Log Reduction Value, LRV）或杀灭率（Killing Rate, KR），从而定量评价受试物的杀菌效力。其核心在于准确计数活菌。
二、试验材料
- 指示菌株： 推荐使用标准菌株，如金黄色葡萄球菌 ATCC 6538。冻干或冷冻保存，试验前按规定程序复苏、鉴定。
- 培养基：
- 营养肉汤培养基（如TSB）：用于菌种活化、传代培养。
- 营养琼脂培养基（如TSA）：用于活菌计数。
- 中和剂（液）：用于中和受试物的残留活性，是试验成功的关键。种类依据受试物性质选择（如硫代硫酸钠中和含氯消毒剂、卵磷脂-吐温80中和季铵盐类）。使用前需进行中和剂鉴定试验。
- 稀释液：常用含中和剂（如0.85%生理盐水+中和剂）的无菌缓冲液（如PBS）。
- 受试物： 待测试的消毒剂、抗菌剂、物理处理设备等。
- 主要器材：
- 恒温培养箱（35±1℃）
- 恒温水浴锅（特定温度）
- 振荡混合器
- 计时器
- 无菌吸管（1ml, 5ml, 10ml）、移液器及无菌吸头
- 无菌试管
- 无菌平皿
- L棒或涂布棒
- 菌落计数器
三、试验步骤
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菌悬液制备：
- 将试验菌株接种于营养肉汤试管中，35±1℃培养18-24小时（形成成熟培养物）。
- 取适量培养物接种于新鲜营养琼脂平板，35±1℃培养18-24小时。
- 用稀释液洗下平板上的菌苔，适当振荡混匀。
- 用稀释液将菌悬液浓度调整至约为1×10⁸ - 5×10⁸ CFU/ml（菌落形成单位/毫升）。可用比浊法初步测定，推荐使用平板活菌计数法精确标定（记为N₀）。
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受试物处理：
- 对照组（阳性对照组）： 取适量菌悬液（如0.5ml）加入足量稀释液（如4.5ml），迅速混匀。此管代表初始菌量。
- 试验组： 取适量菌悬液（体积与对照组相同）加入规定浓度的受试物溶液（或作用于受试物处理环境）中，立即混匀并开始计时。
- 作用时间： 根据试验设计或产品说明，设定一个或多个作用时间点（如1min, 5min, 10min）。
- 中和： 达到预定作用时间时，立即吸取处理后的混合物适量（如1ml），加入含有足量中和剂的试管中（体积通常为9ml，确保中和剂浓度有效且对微生物无毒），迅速充分混匀，终止杀菌作用。此液即为含中和剂的样本液。
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活菌计数：
- 对照组： 选取合适稀释度（如10⁻⁴, 10⁻⁵, 10⁻⁶），用稀释液进行10倍系列稀释。取适量（如1ml）各稀释度液体，倾注法接种于营养琼脂平板上（每皿约15-20ml琼脂，冷却至约45℃），旋转混匀；或用涂布法（取0.1ml稀释液涂布于预凝固的琼脂平板表面）。每个稀释度至少做2个平行。
- 试验组： 对含中和剂的样本液进行10倍系列稀释（稀释度选择预计能使菌落数在30-300CFU/皿的范围）。同样采用倾注法或涂布法接种计数，每个稀释度至少2个平行。
- 培养： 将所有接种好的平板倒置，放入35±1℃恒温培养箱中培养44-48小时。
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计数与记录：
- 取出平板，肉眼或借助菌落计数器计数平板上的菌落数。
- 记录每个平板的菌落数。选择菌落数在30-300CFU之间的平板进行计数，低于30CFU的记录实际数，大于300CFU的记录为“多不可计”（TMTC）。同一稀释度的两个平行平板菌落数相差应小于15%，否则需重做。
四、结果计算
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计算存活菌浓度：
- 对照组平均存活菌浓度（CFU/ml） = (对照组各有效平板菌落数之和 / 平板数) × 对应稀释倍数
- 试验组（某作用时间点）平均存活菌浓度（CFU/ml） = (试验组该时间点各有效平板菌落数之和 / 平板数) × 对应稀释倍数
- 记为：对照组 C₀ (CFU/ml)；试验组 Cₜ (CFU/ml)
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计算杀灭对数值（LRV）：
- LRV = log₁₀(C₀) - log₁₀(Cₜ)
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计算杀灭率（KR）：
- KR (%) = [(C₀ - Cₜ) / C₀] × 100%
五、结果判定
- 定量合格标准： 通常要求达到特定的杀菌对数减少值（LRV）。例如：
- 针对高水平消毒，常要求 ≥ 5.0 LRV（即杀灭率 ≥ 99.999%）。
- 针对中/低水平消毒或抗菌效果评价，要求可能为 ≥ 3.0 LRV（杀灭率 ≥ 99.9%）或更高，依据具体标准或产品宣称确定。
- 阴性对照： 试验应同时设置阴性对照（不含菌的处理液/中和剂混合物），培养后应无菌生长，以确保无菌操作和无菌试剂。
- 重复性： 正式试验通常需要重复多次（如3次），结果应一致或满足重复性要求。
六、质量控制要点
- 中和剂验证： 必须在使用前完成中和剂鉴定试验，确认其能有效中和受试物残留活性，本身无毒且不影响微生物生长。
- 菌悬液浓度准确性： 初始菌量直接影响结果判断，需精确标定。
- 作用时间准确性： 到达作用时间点需立即中和终止反应，计时精确。
- 稀释与接种准确性： 吸管、移液器需校准，稀释和接种操作规范，避免误差。
- 平行设置： 活菌计数必须设置平行平板，减少偶然误差。
- 无菌操作： 整个试验过程需严格无菌操作，防止污染。
- 对照设置： 阳性对照组（C₀）、阴性对照组不可或缺。
七、应用价值
金黄色葡萄球菌定量杀灭试验是评价各类杀菌、抗菌手段效能的核心方法之一，广泛应用于：
- 消毒剂、抗菌剂注册与监督评价： 验证其宣称的杀菌效力。
- 医疗器械消毒灭菌效果验证： 确保器械使用安全。
- 食品加工环境卫生控制： 评估清洁消毒程序有效性。
- 抗菌材料（织物、涂层、塑料等）性能评价： 测定其接触杀菌或抑菌能力。
- 物理杀菌技术（紫外线、臭氧、等离子体等）效能研究： 优化参数。
- 基础微生物学研究： 探究微生物对不同杀菌因子的敏感性。
总结：
金黄色葡萄球菌定量杀灭试验是一种严谨、标准的微生物学检测技术，通过精确控制实验条件（特别是中和环节）和规范操作流程，能够客观、定量地反映受试物对目标菌的杀灭能力。其结果对于保障公共卫生安全、评价产品性能、优化工艺流程具有重要意义。进行该试验必须严格遵循标准化操作规程（SOP）和相关国家/国际标准（如ISO, EN, AOAC, GB等），确保结果的科学性和可比性。