泛耐药菌定量杀灭试验

发布时间：2025-07-01 10:46:56 阅读量：5 作者：生物检测中心

泛耐药菌定量杀灭试验

一、引言

泛耐药菌（Extensively Drug-Resistant Organisms, XDROs）指对几乎全部或所有现行常用抗菌药物种类均呈现高水平耐药的病原微生物，典型代表包括耐碳青霉烯类肠杆菌目细菌（CRE）、耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌（CRAB）、耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌（CRPA）等。这类耐药菌感染治疗选择极为有限，病死率高，对公共卫生构成重大威胁。有效阻断其在医疗机构及环境中的传播是防控关键，其中对消毒剂、抗菌材料、物理消毒方法等的杀菌效力评估至关重要。定量杀灭试验（Quantitative Suspension Test），也称为悬液定量杀菌试验，是评估产品/方法体外杀灭微生物效力（特别是针对特定挑战性微生物如XDROs）的核心标准化方法之一，其结果以微生物浓度对数减少值（Log₁₀ Reduction）表示，客观量化杀灭效果。

二、试验目的与意义

  1. 效力评估： 客观测定受试产品（如化学消毒剂、抗菌涂层、物理消毒技术等）在规定作用浓度（或强度）、作用时间、温度、有机物干扰等条件下，对特定泛耐药菌株的杀灭能力。
  2. 标准化比较： 提供统一的操作规范和评价指标（Log₁₀ Reduction），便于不同产品/方法、不同实验室间结果的横向比较。
  3. 产品开发与优化： 指导新型消毒剂、抗菌材料或消毒技术的研发和改进，筛选有效配方或参数。
  4. 感染控制依据： 为医疗机构、公共卫生部门制定有效的环境清洁消毒方案、选择合格消毒产品或设备提供科学依据，防控XDROs传播。
  5. 符合性验证： 验证受试产品/方法的杀菌效力是否符合相关国家、国际标准（如ISO, ASTM, EN等）或法规要求。
 

三、试验原理

定量杀灭试验的核心原理是模拟产品在实际应用中与微生物接触的条件（液体环境），精确量化接触前后微生物数量的变化。基本流程如下：

  1. 菌悬液制备： 将目标泛耐药菌株在适宜培养基中活化培养至所需生长期（通常为对数生长期），制备成浓度已知、分布均匀的菌悬液。
  2. 受试物作用： 将含有有机干扰物（模拟实际污物，如小牛血清、酵母提取物）的菌悬液与规定浓度的受试产品溶液（或直接作用于受试材料表面，此处主要指悬浮试验）在特定温度下混合。
  3. 计时与中和： 在预设的作用时间点，立即加入足量、有效且对微生物无毒性的中和剂（或采用物理方法如稀释、过滤），迅速终止受试物的杀菌作用，防止残余活性持续影响结果。
  4. 活菌计数： 对中和后的混合液进行系列对数稀释，取适量稀释液接种于固体培养基（倾注法或涂布法）或使用其他定量方法（如膜过滤法）。
  5. 培养与计数： 将接种后的培养基在适宜条件下培养规定时间，计数形成的菌落数（CFU）。
  6. 结果计算： 比较试验组（经受试物处理）与对照组（仅用稀释液或中和剂处理，不含受试物）的活菌浓度，计算微生物数量的对数减少值（Log₁₀ Reduction Value, LRV）。
 

四、关键试验材料

  1. 测试菌株： 严格鉴定的目标泛耐药菌株（如特定CRE、CRAB、CRPA菌株），通常要求使用标准菌株或临床分离株（需明确耐药谱）。菌株需在有效管理下保藏和传代。
  2. 培养基： 用于菌种复苏、增菌、维持及活菌计数的适宜培养基（如胰酪大豆胨琼脂/肉汤TSA/TSB、营养琼脂/肉汤NA/NB等），需进行无菌性及促生长能力验证。
  3. 有机干扰物： 模拟实际污垢，常用小牛血清（通常终浓度0.3%-3.0%）、酵母提取液等，用于评估有机物对杀菌效果的影响。
  4. 稀释液与悬浮液： 用于稀释菌液和受试物的无菌缓冲溶液（如磷酸盐缓冲液PBS、硬水），要求对微生物无抑制或促进生长作用。
  5. 中和剂： 至关重要！ 必须能立即、完全中和受试物的残留杀菌活性，且自身对测试微生物无毒，不影响其复苏生长。常用组合包括卵磷脂+聚山梨酯80（中和季铵盐、酚类、双胍类）、硫代硫酸钠（中和含氯、碘消毒剂）、组氨酸/甘氨酸（中和醛类）、D/E中和肉汤（广谱中和剂）等。必须预先进行中和剂有效性及细胞毒性验证试验。
  6. 受试产品/材料： 按规定方法配制或处理的待测消毒剂溶液或抗菌材料样本。
  7. 仪器设备： 恒温培养箱、恒温水浴振荡器、生物安全柜、移液器、菌落计数器、pH计、计时器、无菌吸管/吸头、培养皿等。
 

五、试验方法步骤

  1. 菌悬液制备：

    • 从新鲜培养物（通常18-24小时）挑取单菌落接种至肉汤培养基。
    • 在适宜温度（通常30-37℃）下振荡培养至对数生长期中期（通常培养时间根据菌种确定，如6-18小时）。
    • 离心（或膜过滤）收集菌体，用无菌稀释液（含规定浓度有机干扰物）洗涤并重悬，调整浓度至约1×10⁸ - 1×10⁹ CFU/mL（具体目标浓度需根据标准要求）。使用比浊法或活菌计数法精确标定初始浓度（N₀）。

  2. 受试物准备： 按使用说明或试验设计，用硬水或规定稀释液配制所需浓度的受试消毒剂溶液。抗菌材料则制备成特定形态（如薄片）备用。

  3. 作用过程（悬浮试验）：

    • 将预热至规定温度（通常20±1℃）的受试物溶液（或材料）和无菌稀释液（含干扰物）按比例混合（如9份受试液+1份菌悬液）。
    • 立即启动计时器，并迅速混匀（对于溶液试验通常在振荡水浴中进行以确保充分接触）。
    • 在预设的作用时间点（如0.5分钟、1分钟、2分钟、5分钟、10分钟等），立即取1.0 mL混合液加入到含有9.0 mL预冷（通常4℃，终止反应）且已验证有效的中和剂试管中（或直接加入足量有效中和剂），充分涡旋混匀至少10-30秒以彻底中和。

  4. 对照设置：

    • 菌悬液活力对照： 直接用含中和剂的稀释液冲洗菌悬液（不含受试物），测定初始活菌浓度（用以验证实验过程中菌悬液本身的存活状态）。
    • 阴性（稀释液/中和剂）对照： 用不含受试物的稀释液或中和剂代替受试物，按相同步骤操作，验证稀释液/中和剂对微生物无影响（应无明显杀菌或促生长作用）。
    • 中和剂效能及毒性对照： （验证步骤中已进行，试验中可不重复，但需报告结果）证明中和剂能有效中和受试物且自身对微生物无毒。

  5. 活菌计数：

    • 对中和后的样本（试验组及对照组）立即进行系列10倍稀释（通常用生理盐水或适宜的缓冲液）。
    • 选择2-3个适宜稀释度，各取1.0 mL进行倾注平板（或0.1 mL进行涂布平板），每个稀释度至少做2个平行。
    • 将平板倒置于规定温度（通常30-37℃）培养规定时间（通常24-72小时，根据菌种而定）。

  6. 菌落计数： 培养结束后，计数平板上的菌落形成单位（CFU）。选择菌落数在30-300 CFU之间的平板进行计数（涂布法也可考虑20-200 CFU范围）。计算各稀释度下每毫升（或每份样本）的平均CFU。

 

六、结果计算与判读

  1. 计算活菌浓度：
    • 根据计数的平板菌落数和稀释倍数，计算出中和后样本中每毫升的活菌浓度（单位：CFU/mL）。
    • 试验组活菌浓度（Nₓ）： 受试物作用时间t分钟后的活菌浓度。
    • 对照组活菌浓度（N₀）： 菌悬液活力对照组（作用时间0时刻）的活菌浓度（代表初始加入的活菌量）。
  2. 计算对数减少值（LRV）：
  
 
 
 
LRVₜ = lg N₀ - lg Nₓ
 
 
 
* `LRVₜ`: 作用时间t分钟后的对数减少值。 * `lg N₀`: 对照组活菌浓度（N₀）的以10为底的对数值。 * `lg Nₓ`: 试验组活菌浓度（Nₓ）的以10为底的对数值。 * **重要：** `N₀` 和 `Nₓ` 必须使用相同的单位（通常为 CFU/mL）。确保 `N₀` 是 **作用起点（t=0）** 的浓度，由活力对照测得。

3. 结果判读：
* Log₁₀ Reduction值： 这是定量评价杀菌效果的核心指标。例如，LRV = 3 表示微生物数量减少了1000倍（99.9%杀灭率），LRV = 4 表示减少了10000倍（99.99%杀灭率），LRV = 5 表示减少了100000倍（99.999%杀灭率）。
* 评价标准： 特定标准或应用场景会对不同作用时间点所需达到的最低LRV值做出要求（如消毒剂标准常要求在1-5分钟内达到LRV≥4或≥5）。需根据试验目的参照相应标准或预设阈值进行判读。通常要求试验组数据来自多个平行样本且标准差符合要求。

七、关键质量控制点

  1. 菌悬液质量： 确保菌株纯、处于对数期、浓度准确且分布均匀。定期进行生化或分子鉴定。
  2. 中和剂验证： 绝对核心！ 必须严格完成并记录中和剂有效性（能完全中和受试物残留活性）和无毒性/无促生长作用（对微生物生长无明显影响）的验证试验。
  3. 作用条件的控制： 精确控制温度、作用时间（计时准确）、混合方式（确保充分接触）。有机物干扰物浓度需符合标准要求。
  4. 稀释与接种准确性： 使用精确的移液设备，确保稀释梯度准确，接种量一致。
  5. 对照设置的完整性： 必须包含所有必要的对照（活力对照、阴性对照），其结果需符合预期要求，试验结果方为有效。
  6. 无菌操作： 全过程在生物安全柜内或严格无菌条件下进行，防止污染。
  7. 数据记录与统计分析： 详细记录所有操作步骤、参数、原始数据（各平板菌落数），应用合适的统计方法（如计算平均数、标准差），确保结果可追溯、可重复。
 

八、应用与局限性

  • 应用：
    • 注册消毒剂上市前的杀菌效力评价。
    • 抗菌医疗器械、医用纺织品、环境表面涂层等抗菌性能评价。
    • 新型物理消毒技术（如紫外线、等离子体）杀菌效果研究。
    • 消毒剂使用浓度、作用时间参数的优化。
    • 比较不同产品/方法针对特定XDRO的杀菌效能。
  • 局限性：
    • 模拟环境： 主要在液体悬液中进行，不能完全模拟实际应用中复杂的干态表面、生物膜或器械管腔等环境条件。
    • 单一菌种： 通常针对单一菌种测试，实际污染常为多种微生物共存。
    • 无机械去除作用： 试验主要评价化学/物理杀灭作用，不包含清洁过程（擦拭、冲洗）的物理去除作用。
    • 实验室条件： 结果受实验室操作条件和具体菌株影响。需结合载体定量试验、现场模拟试验甚至现场试验进行更全面的评估。
 

九、结论

定量杀灭试验是评估消毒剂、抗菌材料及物理消毒方法对泛耐药菌体外杀菌效力的基础且重要的标准化实验室方法。通过严格控制试验条件、严谨执行操作流程（特别是中和剂验证）、精确计算微生物对数减少值（Log₁₀ Reduction），该试验能够提供客观、定量的数据，为防控威胁巨大的泛耐药菌感染、指导有效消毒措施的制定和合格产品的选择提供关键的科学依据。理解其原理、严格执行方法学要求并认识其局限性，对于获得可靠、可比较的结果至关重要。在应对全球日益严峻的抗菌药物耐药性挑战中，此类标准化体外效力试验发挥着不可或缺的作用。