血小板聚集的体外测定

血小板聚集的体外测定：原理、方法与临床意义

血小板在止血和血栓形成中扮演着核心角色。当血管内皮受损时，血小板被激活并粘附于损伤部位，随后相互聚集形成血小板栓子，这是初级止血的关键步骤。体外血小板聚集测定是评估血小板功能最常用和最重要的实验室方法之一，广泛应用于出血倾向评估、抗血小板药物疗效监测及血栓风险研究等领域。

一、 基本原理

体外血小板聚集测定的核心原理是：模拟体内环境，在体外加入特定的血小板激活剂（诱导剂），引发富含血小板的血浆（PRP）或全血中的血小板发生聚集反应，并通过特定的物理或化学方法检测聚集的程度和速度。

二、 主要测定方法

1. 光学比浊法 (Light Transmission Aggregometry, LTA) - 金标准法

   • 样本： 使用枸橼酸钠抗凝的静脉血，通过特定的离心条件制备富含血小板血浆（PRP）和乏血小板血浆（PPP）。
   • 原理： 将PRP置于恒温（37°C）的比色杯中，仪器透过的光量较低（浊度高）。加入血小板激活剂后，血小板开始聚集形成聚集体，血浆逐渐变得澄清，透光率增加。仪器连续监测透光率的变化（通常以PPP的透光率设定为100%，PRP初始透光率设定为0%），并绘制成聚集曲线。
   • 关键参数：
     • 最大聚集率 (Maximum Aggregation, %MA)： 聚集反应达到的最大透光率变化百分比，反映聚集的程度。
     • 聚集速度 (Slope/Aggregation Velocity)： 聚集曲线达到最大聚集率的斜率，反映聚集的快慢。
     • 达到最大聚集率的时间 (Lag Time)： 从加入诱导剂到聚集开始明显加速的时间。
     • 二级聚集波 (Secondary Aggregation Wave)： 某些诱导剂（如ADP、肾上腺素）在特定浓度下可引发两相聚集波，第二波依赖于血小板释放的内源性物质（如ADP、血栓烷A2）。
   • 常用诱导剂： 腺苷二磷酸（ADP）、胶原（Collagen）、花生四烯酸（Arachidonic Acid, AA）、肾上腺素（Epinephrine）、瑞斯托霉素（Ristocetin）、凝血酶（Thrombin）、血栓烷类似物（如U46619）等。不同诱导剂通过激活血小板表面不同的受体通路引发聚集。
   • 优点： 历史悠久，方法标准化程度相对较高（有国际指南），能提供详细的动力学信息，被认为是血小板功能检测的“金标准”。
   • 缺点： 样本处理步骤多（离心制备PRP/PPP），操作相对复杂，耗时（约1-1.5小时），对样本处理（如离心速度、时间、温度）和检测条件（搅拌速度、温度）要求严格，样本体积需求较大，不易自动化。

2. 全血电阻抗法 (Whole Blood Impedance Aggregometry)

   • 样本： 使用枸橼酸钠或肝素抗凝的全血。
   • 原理： 将一对电极浸没在全血样本中，加入激活剂后，血小板在电极表面聚集粘附，导致电极间电阻抗增加。仪器连续监测电阻抗的变化，并绘制成聚集曲线。
   • 关键参数： 类似LTA，包括最大聚集率（通常以欧姆表示）、聚集速度等。
   • 常用诱导剂： 与LTA类似（ADP、胶原、AA、TRAP等）。
   • 优点： 使用全血样本，无需离心制备PRP/PPP，更接近生理状态（保留了红细胞、白细胞的影响），操作相对简单快速，样本量需求较少。
   • 缺点： 结果可能受血细胞比容、白细胞计数等因素影响更大，标准化程度不如LTA高，历史数据积累相对少。

3. 快速血小板功能检测法 (Rapid Platelet Function Assays)

   • 这类方法旨在提供更快速、简便、床旁化的检测选项，常用于抗血小板药物（尤其是P2Y12受体拮抗剂，如氯吡格雷）的即时监测。
   • 常见类型与原理：
     • 基于比浊原理的简化仪器： 使用特殊设计的比色皿和光学系统，操作比传统LTA更简便快速。
     • 血小板功能分析仪 (PFA)： 利用高剪切力模拟血管损伤，测定枸橼酸化全血在覆盖有胶原和特定激动剂的膜上形成血小板栓子（闭塞孔洞）所需的时间（闭合时间）。主要反映血小板粘附、活化和聚集的综合能力，对阿司匹林敏感。
     • VerifyNow 系统： 基于浊度原理的专用床旁设备。使用特定的检测管，管内预包被了纤维蛋白原包被的微珠和特定的诱导剂（如AA用于阿司匹林反应单位，ADP+PGE1用于P2Y12反应单位）。血小板聚集会导致微珠凝集，透光率增加。结果直接以阿司匹林反应单位或P2Y12反应单位报告。
     • 多电极聚集法 (MEA)： 在富含血小板血浆或全血中插入多对电极，通过测量电极间电阻抗的变化来评估血小板聚集。类似阻抗法，但允许多个样本同时检测。
     • 血管扩张剂刺激磷蛋白磷酸化 (VASP) 流式细胞术检测： 并非直接检测聚集，而是通过流式细胞术检测血小板内P2Y12受体下游信号分子VASP的磷酸化水平，精确量化P2Y12受体被抑制的程度。
   • 优点： 操作简便快速，部分可床旁操作，样本处理简单（尤其是全血法），自动化程度高，适合临床快速监测。
   • 缺点： 不同方法原理差异大，结果之间可比性有限，部分方法提供的信息不如LTA全面，标准化仍在进行中。

三、 关键参数解读与临床意义

• 聚集率降低：
  • 遗传性血小板功能缺陷：
    • 对ADP无反应：提示P2Y12受体缺陷（如Glanzmann血栓无力症的部分亚型？ 注：GT主要为GPIIb/IIIa缺陷）。
    • 对AA无反应：提示环氧化酶（COX-1）缺陷或血栓烷A2合成酶/受体缺陷。
    • 对瑞斯托霉素无反应：提示血管性血友病因子（vWF）缺乏或GP Ib-IX-V复合物缺陷（如Bernard-Soulier综合征）。
    • 对多种诱导剂无反应：常见于Glanzmann血栓无力症（GPIIb/IIIa缺陷）、灰色血小板综合征（α颗粒缺陷伴轻度聚集缺陷）等。
  • 获得性血小板功能缺陷：
    • 药物影响： 阿司匹林（不可逆抑制COX-1，影响AA途径）、P2Y12受体拮抗剂（氯吡格雷、普拉格雷、替格瑞洛等）、糖蛋白IIb/IIIa受体拮抗剂（阿昔单抗、替罗非班、依替巴肽）、磷酸二酯酶抑制剂（双嘧达莫、西洛他唑）、非甾体抗炎药（可逆抑制COX）。
    • 尿毒症： 毒素积累影响血小板功能。
    • 骨髓增殖性肿瘤： 可能伴有获得性vWD或内在缺陷。
    • 抗血小板抗体。
    • 体外循环/心肺转流。
• 聚集率增高：
  • 高凝状态/血栓风险： 如动脉粥样硬化、急性冠脉综合征、卒中、糖尿病、高脂血症、妊娠期、吸烟等。虽然个体差异大，群体研究显示聚集活性增高与血栓事件风险相关。
  • 某些遗传性易栓症。
  • 炎症状态。
• 监测抗血小板治疗：
  • 阿司匹林： 常用AA诱导的LTA或VerifyNow ASA试验检测其有效性（抑制COX-1）。阿司匹林抵抗可能提示疗效不佳或心血管事件风险增加。
  • P2Y12受体拮抗剂： 常用ADP诱导的LTA、VerifyNow PRUTest、VASP检测等评估其抑制强度。高残余血小板反应性与支架血栓、心肌梗死等缺血事件风险增加相关；过度抑制则可能增加出血风险。
  • GPIIb/IIIa拮抗剂： 在PCI术中使用时，常需床旁监测（如VerifyNow IIb/IIIa试验）以确保达到足够的抗血小板效果。

四、 质量控制与注意事项（至关重要）

血小板聚集试验结果受多种因素影响，严格控制实验条件对结果可靠性至关重要：

1. 样本采集与处理：

   • 抗凝剂： 枸橼酸钠（3.2%或3.8%）是标准抗凝剂。肝素影响聚集反应，通常不使用EDTA（会引起血小板形态改变）。
   • 采血： 应“一针见血”，避免组织液混入激活血小板。止血带压力不宜过大、时间不宜过长。
   • 样本运送与静置： 采血后应轻柔混匀，室温运送，避免剧烈震荡、高温或低温。检测前需室温静置一段时间（通常15-30分钟）让血小板恢复静息状态，但总检测时间窗（从采血到完成检测）应严格控制在2-4小时内（尤其LTA）。
   • 离心： 制备PRP/PPP的离心速度和时间必须标准化。离心过度会激活血小板或损失大血小板；离心不足则PRP中混入过多白细胞/红细胞影响浊度。离心温度应为室温。
   • 血小板计数： PRP的血小板计数应调整到合适范围（如150-350 × 10⁹/L），计数过低或过高均影响结果。PPP的血小板计数应<10 × 10⁹/L。

2. 检测过程：

   • 温度： 必须严格控制在37°C（模拟体内环境）。
   • 搅拌速度： 比色杯内的搅拌速度（通常900-1200 rpm）必须保持一致和适宜，过低影响激活剂混合和血小板碰撞，过高可能损伤血小板。
   • 诱导剂： 来源、浓度、配制方法、储存条件（尤其AA、凝血酶不稳定）需标准化。不同浓度可能揭示不同问题（如低浓度ADP检测二级波）。
   • 仪器校准与维护： 定期用PPP和标准品校准仪器基线（0%和100%透光率）。
   • 样本准备： PRP检测前应再次混匀（避免血小板沉降），检测过程中避免产生气泡。

3. 干扰因素：

   • 脂血、溶血、黄疸： 影响光学法（LTA）的透光率读数。
   • 药物： 除抗血小板药外，抗生素、抗抑郁药、心血管药物等也可能影响血小板功能，需详细记录用药史。
   • 生理状态： 剧烈运动、应激、月经周期、饮食（如摄入富含ω-3脂肪酸食物）等也可能产生短暂影响。
   • 吸烟： 可增强血小板反应性。

五、 报告与解读

报告应清晰包含：

• 患者信息、样本信息（采血时间）。
• 使用的检测方法（LTA、阻抗法等）。
• 所用诱导剂及其浓度（非常重要）。
• 关键检测结果（如各诱导剂的最大聚集率%，阻抗值Ω，闭合时间秒，PRU/ARU值等）。
• 参考范围（应在本地实验室建立的条件下确定）。
• 对结果的简要描述（如“正常”、“降低”、“增高”）以及对可能临床意义的提示（需结合临床情况）。
• 声明检测局限性（如样本稳定性、干扰因素等）。

解读必须由经验丰富的检验医师或血液科医师结合患者的临床表现、病史、用药史、其他实验室检查结果（如血常规、凝血功能）等进行综合分析。 单次异常的检测结果需谨慎判断，必要时复查确认。对于遗传性疾病的诊断，常需结合家系调查和其他特异性检查（如流式细胞术检测血小板膜糖蛋白、基因检测等）。

六、 总结

体外血小板聚集测定是评估血小板功能不可或缺的工具。光学比浊法（LTA）作为金标准提供详细的动力学信息，而全血阻抗法和各种快速检测法则在便捷性和床旁应用方面具有优势。理解不同方法的原理、优缺点和适用范围至关重要。严格的质量控制是获得可靠结果的基石。检测结果需要结合临床背景进行专业解读，为出血性疾病、血栓性疾病的风险评估以及抗血小板治疗的个体化管理提供重要的实验室依据。随着技术的进步，更快速、精确、信息全面的检测方法仍在持续发展中。