激光光凝诱导的脉络膜新生血管模型

发布时间：2025-07-01 01:06:14 阅读量：1 作者：生物检测中心

激光光凝诱导的脉络膜新生血管模型：机制、建立与应用

脉络膜新生血管（CNV）是湿性年龄相关性黄斑变性（wAMD）、病理性近视等致盲眼病的核心病理改变。深入理解其发生机制、筛选有效疗法离不开可靠的疾病模型。在众多模型中，激光光凝诱导法因其操作相对简便、成模率高、病变特征与人类CNV高度相似，成为基础和转化研究的基石。

一、 模型建立原理与核心机制

该模型的核心是利用激光能量精确诱导局部视网膜色素上皮（RPE）-Bruch膜复合体的机械性损伤，高度模拟人类CNV发生的起始关键步骤：

  1. 靶点选择与损伤： 通常选择啮齿类动物（大鼠、小鼠、荷兰猪）或非人灵长类动物的后极部视网膜区域。特定波长（常用532nm绿光或647nm红光）的激光束聚焦于RPE层。
  2. Bruch膜破裂： 高能量激光瞬间产生的热效应或光化学反应，导致靶点处RPE细胞坏死、Bruch膜完整性破坏，形成一个微小的“伤口”。
  3. 炎症反应启动： 组织损伤释放损伤相关分子模式（DAMPs），招募并激活局部小胶质细胞、巨噬细胞等炎症细胞，释放大量炎症因子（如TNF-α, IL-1β, IL-6）。
  4. 血管生成因子级联： 炎症微环境及缺氧应激强烈上调血管内皮生长因子（VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、胎盘生长因子（PlGF）等关键促血管生成因子的表达。
  5. 新生血管萌芽与生长： 高浓度的促血管生成因子作用于邻近脉络膜毛细血管内皮细胞，刺激其增殖、迁移，穿过受损的Bruch膜缺口，向视网膜下间隙侵袭性生长，形成典型的CNV病灶。新生血管结构紊乱、通透性高，易渗漏出血和液体积聚。
  6. 瘢痕化： 随着时间推移（通常数周），新生血管周围逐渐被激活的RPE细胞、成纤维细胞及沉积的细胞外基质（主要是胶原）包裹，最终形成纤维血管性瘢痕（盘状瘢痕），模拟了wAMD晚期的病理结局。
 

二、 标准操作流程（以C57BL/6小鼠为例）

  1. 动物准备：
    • 选用6-8周龄健康雄性/雌性小鼠。
    • 麻醉：腹腔注射合适剂量的麻醉剂混合物（如氯胺酮/甲苯噻嗪）。
    • 散瞳：眼部滴用散瞳眼药水。
    • 角膜保护：涂抹透明角膜凝胶防止干燥。
  2. 激光光凝操作：
    • 将麻醉动物固定于裂隙灯显微镜配套的动物操作平台。
    • 放置覆盖无菌生理盐水或凝胶的角膜接触镜以提供清晰视野。
    • 选择激光参数（典型示例）：
      • 波长：532nm（绿光）或 647nm（红光）。
      • 光斑大小：50 - 100 μm。
      • 曝光时间：50 - 100 ms。
      • 功率：初始尝试50-100mW，需根据特定设备校准并通过预实验确定能在RPE层产生清晰灰白色气泡的最低有效功率（避免过度出血或视网膜穿孔）。
    • 在视盘周围约1-2个视盘直径（DD）区域，避开主要血管，均匀诱导4-6个激光斑。每个光斑间距至少1个光斑直径。
    • 观察指标：成功光凝点瞬间可见RPE层灰白色气泡形成或轻微爆破音。
  3. 术后护理： 移除接触镜，涂抹抗生素眼膏预防感染，动物放回笼中保暖苏醒。
 

三、 模型评价与验证方法

  1. 眼底彩色照相： 即刻观察激光斑位置，后期观察病灶渗漏、出血、色素沉着及瘢痕形成。
  2. 荧光素眼底血管造影（FFA）：
    • 时机： 通常在激光后7-14天进行（CNV生长高峰期）。
    • 表现： 典型表现为早期激光斑处强荧光（窗样缺损），中期荧光素渗漏（云雾状强荧光），晚期荧光素积存（强荧光团），是判断CNV活动和渗漏的金标准。
  3. 吲哚青绿血管造影（ICGA）： 主要用于显示深层脉络膜循环和较大的CNV滋养血管。
  4. 光学相干断层扫描（OCT）：
    • 结构OCT： 清晰显示CNV病灶形态（团状或线状高反射信号突破RPE层）、视网膜下积液/出血、RPE脱离、视网膜水肿增厚等结构改变。
    • OCT血管成像（OCTA）： 无创、分层显示CNV血管网（典型表现为边界不清的“绒团状”或“海扇状”高血流信号），定量分析CNV面积、血流密度等，极大方便了纵向监测。
  5. 组织病理学检查（终点验证）：
    • 取材： 通常在激光后7-28天进行组织学分析（7-14天为新生血管活跃期，21-28天为瘢痕化期）。
    • 切片染色：
      • 苏木精-伊红（H&E）：直观显示视网膜结构破坏、CNV病灶位置（脉络膜来源的新生血管芽穿过Bruch膜缺损长入视网膜下间隙）、炎症细胞浸润、出血、积液及纤维化。
      • 特殊染色：
        • 过碘酸-希夫（PAS）：清晰显示基底膜（包括Bruch膜缺损及新生血管基底膜）。
        • 天狼星红（Sirius Red）：评估胶原沉积和纤维化程度（偏振光下观察）。
      • 免疫组织化学/免疫荧光染色（IHC/IF）：
        • 血管内皮标记物：CD31（PECAM-1）, CD34, ERG, Isolectin B4（IB4）等标记新生血管内皮细胞，计算CNV面积或体积。
        • 炎症细胞标记物：F4/80（巨噬细胞）, Iba1（小胶质细胞/巨噬细胞）, Ly6G（中性粒细胞）等评估炎症浸润程度。
        • 增殖标记物：Ki67, PCNA评估细胞增殖活性。
        • 关键因子：VEGF, VEGFR2, 炎症因子（TNF-α, IL-1β）等在病灶内的表达定位。
    • 脉络膜铺片（Choroidal Flatmount）： 分离RPE/脉络膜/巩膜复合体，用内皮细胞特异性染料（如Isolectin B4）整体染色，在荧光显微镜下清晰显示CNV血管网的二维立体结构，是定量CNV面积的经典方法。
 

四、 模型优势与局限性

  • 优势：

    1. 病理相似性高： CNV的发生部位（视网膜下）、结构特点（起源于脉络膜毛细血管、突破Bruch膜）、病理过程（炎症启动、血管生成、渗漏出血、瘢痕化）以及关键的分子机制（VEGF等因子高表达）高度模拟了人类wAMD。
    2. 操作相对简便，成本较低（尤其啮齿类）。
    3. 成模率高且稳定： 在熟练操作下，诱导成功率通常>80%。
    4. 时间窗明确： CNV在术后约7天开始明显生长，14天达到高峰，便于实验设计和干预。
    5. 评价手段成熟多样： FFA、OCT、组织学等评价方法成熟可靠。
    6. 是药物筛选的金标准模型： 验证抗VEGF药物疗效的核心模型，几乎所有获批的wAMD药物均在该模型上验证过有效性。

  • 局限性：

    1. 急性损伤诱导： 人类CNV（尤其AMD）是慢性退行性疾病基础上发生的。激光模型模拟的是Bruch膜破裂这一关键步骤，但缺乏AMD中RPE功能障碍、脂质沉积（玻璃膜疣）、补体激活等慢性病理背景。
    2. 炎症反应剧烈： 激光造成的急性组织损伤引发的炎症反应可能比人类慢性AMD更为剧烈和广泛。
    3. 病灶大小与均一性： 个体间CNV病灶大小存在一定差异，需要足够的样本量。病灶较小。
    4. 自发吸收倾向： 部分动物（尤其小鼠）病灶在后期可能部分自发吸收，不完全等同于人类CNV的持续进展。
    5. 物种差异： 啮齿类动物眼底结构与人类存在差异（如无视锥细胞富集的黄斑）。大型动物（兔、猴）模型更接近人类，但成本高、操作更复杂。
 

五、 应用价值

  1. 发病机制研究： 深入探究炎症、血管生成、氧化应激、细胞外基质重塑、免疫调控等在CNV发生发展中的作用；利用基因敲除/转基因动物研究特定基因功能。
  2. 治疗靶点发掘与验证： 筛选和验证针对VEGF信号通路及其他潜在靶点（如Ang/Tie2, PDGF, 补体, 炎症因子等）的新药/新疗法（抗体、小分子抑制剂、基因治疗）。
  3. 给药途径与递送系统评价： 评估眼内注射、玻璃体腔缓释装置、纳米载体、基因载体等不同给药方式的疗效、安全性和药代动力学。
  4. 现有疗法优化： 优化抗VEGF药物的剂量、给药频率、联合用药策略以及耐药性机制研究。
  5. 再生医学研究： 评估干细胞移植、RPE替代等在抑制CNV和修复损伤方面的潜力。
 

总结

激光光凝诱导的脉络膜新生血管模型，通过精准Bruch膜破裂这一关键病理事件，成功模拟了人类CNV的核心特征。尽管存在急性损伤诱导、缺乏完整慢性背景等局限性，其高度的病理相似性、技术的可操作性、评价体系的成熟性以及作为抗VEGF疗法验证的金标准地位，使其在眼科基础研究和新药开发中不可或缺。持续优化模型建立标准、结合多模态影像和组学技术、探索与其他AMD病理特征模型的联合应用，将进一步拓展其在揭示CNV复杂机制和推动创新疗法转化中的价值。

主要参考文献：

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  3. Lambert, V., Lecomte, J., Hansen, S., Blacher, S., Gonzalez, M. L. A., Struman, I., ... & Rakic, J. M. (2013). Laser-induced choroidal neovascularization model to study age-related macular degeneration in mice. Nature Protocols, 8(11), 2197–2211.
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  5. Penn, J. S., Madan, A., Caldwell, R. B., Bartoli, M., Caldwell, R. W., & Hartnett, M. E. (2008). Vascular endothelial growth factor in eye disease. Progress in Retinal and Eye Research, 27(4), 331–371. (包含对激光CNV模型的详细讨论)
 

此模型作为研究脉络膜新生血管及相关眼底疾病的核心工具，其标准化建立与严谨评价是获取可靠科学结论的基石。