胆管结扎诱导肝脏纤维化模型：原理、方法与机制
胆管结扎（Bile Duct Ligation, BDL）模型是研究胆汁淤积性肝损伤、肝纤维化及肝硬化发病机制和潜在治疗策略的经典且高度可控的体内实验模型。其核心原理是通过物理阻断胆总管，模拟人类胆道梗阻性疾病（如胆总管结石、胆管狭窄、胆管癌等），诱导肝内胆汁淤积，进而触发一系列复杂的炎症反应和纤维化级联过程。
一、模型构建方法（以大鼠模型为例）
-
动物准备：
- 常用雄性成年大鼠（如SD、Wistar品系），体重180-250g。
- 术前禁食过夜（自由饮水）。
- 麻醉：推荐使用吸入麻醉（如异氟烷）或腹腔注射麻醉剂。
- 备皮消毒：腹部剃毛，碘伏和医用酒精常规消毒手术区域。
- 保温：手术全程动物置于恒温手术台上，维持体温（37℃±1℃）。
-
手术操作：
- 切口： 沿腹中线做约2-3cm纵行切口，逐层切开皮肤、肌肉和腹膜。
- 暴露胆总管： 轻柔将胃、十二指肠等脏器向右侧推移，或使用浸有生理盐水的无菌纱布包裹脏器推向一侧。在肝门部、十二指肠与胰腺之间清晰辨识胆总管（白色半透明管状结构，通常在门静脉前方）。识别时应避免损伤周围血管。
- 游离与结扎： 使用精细显微手术器械（如细镊子、显微剪）仔细钝性分离胆总管周围少量结缔组织，游离出约5-10mm长的一段胆总管。确保充分游离以避免结扎时损伤邻近结构（特别是门静脉）。
- 双重结扎： 使用不可吸收性外科缝线（如丝线、聚丙烯线）在游离的胆总管段上进行两道紧密结扎，两道结扎点间隔约3-5mm。
- 切断胆管（可选但常用）： 在两道结扎线之间使用显微剪完全切断胆总管。此步骤可确保胆管完全梗阻，防止再通。切断后需确认无出血。
- 关腹： 逐层缝合腹壁肌肉层和皮肤。缝合应严密，避免术后疝形成。
-
对照组设置：
- 假手术组： 经历相同的手术流程（开腹、暴露胆总管、钝性分离），但不进行结扎和切断操作。这是最重要的对照组，用于排除手术创伤本身对实验结果的影响。
- 正常对照组： 不经受任何手术处理的健康动物。
-
术后护理：
- 保暖与苏醒： 动物移至温暖、安静、干燥的环境直至完全苏醒。
- 镇痛： 术后必须给予充分镇痛管理（如腹腔注射布托啡诺等），持续时间根据动物疼痛评估决定（通常至少48-72小时）。
- 补液与营养： 术后早期可皮下注射温生理盐水补充体液。恢复饮食后提供充足饮水和标准饲料。
- 监测： 密切观察动物状态（活动、摄食饮水、伤口情况、黄疸有无等）。出现严重并发症（如腹膜炎、伤口感染、衰弱）需及时安乐死处理。
二、肝脏病理进程与纤维化机制
BDL后肝脏病理变化呈现明确的时间依赖性：
- 急性期（术后1-7天）：
- 胆汁淤积： 胆管梗阻导致肝内胆汁酸蓄积，直接损伤胆小管上皮细胞（Hering管和胆管细胞）及肝细胞膜。
- 炎症反应： 受损细胞释放损伤相关分子模式（DAMPs）。胆汁酸激活肝窦内皮细胞和枯否细胞（肝脏巨噬细胞）上的Toll样受体（如TLR4、TLR9）和胆汁酸受体（如TGR5），触发NF-κB等信号通路，导致大量促炎因子（TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1等）产生和释放。中性粒细胞浸润是早期（24-72小时）显著特征。
- 肝细胞损伤与凋亡： 胆汁酸毒性、炎症因子风暴、氧化应激（活性氧ROS大量产生）共同导致肝细胞气球样变性、坏死和凋亡。血清ALT、AST、胆红素（TBIL）、碱性磷酸酶（ALP）、γ-谷氨酰转肽酶（GGT）显著升高。
- 增殖与纤维化启动期（术后7-14天）：
- 胆管反应： 胆小管上皮细胞/肝祖细胞增殖，形成新生的、不规则的胆管样结构（胆管反应），这是对胆道损伤和胆汁淤积的适应性反应。
- 肝星状细胞活化： 这是纤维化发生的核心环节。炎症因子（尤其是TGF-β1, PDGF）、氧化应激、胆汁酸本身、损伤肝细胞释放的脂质过氧化产物（如MDA）以及细胞外基质（ECM）成分改变，共同激活肝星状细胞（HSCs）。激活的HSCs转化为肌成纤维细胞样细胞（MFB），失去储存维生素A脂滴的能力，获得增殖、迁移、收缩能力，并大量合成和分泌以I型胶原蛋白为主的细胞外基质成分。
- 纤维化沉积： 胶原纤维开始在门静脉周围区域沉积，形成纤维间隔。此时组织学（如苏木精-伊红H&E染色、天狼星红或Masson三色染色）可清晰观察到纤维化形成。
- 进展期（术后14-28天）：
- 纤维化扩展与桥接： 门静脉周围的纤维隔持续增厚，并向肝小叶内延伸，与邻近的门管区或中央静脉相连，形成桥接纤维化。窦周隙（Disse间隙）内亦有网状纤维沉积（窦周纤维化）。
- 持续炎症与损伤： 胆汁淤积持续，炎症反应有所减弱但仍持续存在，肝细胞损伤和胆管反应持续进行。
- 结构重塑： 肝实质逐渐被纤维瘢痕组织分割，肝脏结构开始紊乱，向早期肝硬化发展。
- 晚期（术后>28天）：
- 假小叶形成（肝硬化）： 广泛的桥接纤维化将肝实质分割包围，形成大小不等的再生结节（假小叶），标志着肝硬化形成。
- 肝功能衰竭： 肝实质细胞显著减少，肝内血管扭曲受压，导致门静脉高压（表现为腹水、脾肿大、侧支循环开放等）和进行性肝功能减退。
- 并发症： 动物逐渐出现黄疸加深、消瘦、腹水、活动减少、凝血功能障碍等症状，生存率显著下降。
三、模型优势与局限性
- 优势：
- 高度可重复性： 手术操作标准化程度较高，诱导的肝纤维化/肝硬化进程明确、时间可预测。
- 病理生理模拟性好： 能精确模拟人类胆汁淤积性肝病的核心特征：胆道梗阻、胆管反应、胆汁酸毒性、渐进性肝纤维化直至肝硬化。
- 纤维化进程迅速且显著： 通常2-4周内即可观察到明显的肝纤维化至肝硬化，实验周期相对较短。
- 机制研究平台： 是研究胆汁淤积、炎症、HSC活化、纤维化发生发展及潜在抗纤维化治疗靶点和药物的理想模型。
- 局限性：
- 手术创伤： 尽管有假手术对照，手术本身仍会造成一定应激和炎症反应。
- 动物死亡率： 术后早期（特别是最初几天）存在一定死亡率，主要原因包括麻醉意外、手术并发症（出血、感染）、胆漏、急性肝功能衰竭等。存活率随结扎时间延长而下降。
- 不适于研究纤维化逆转： 持续的胆道梗阻是纤维化的根本驱动因素。移除结扎（如BDL后再通模型）可部分研究逆转，但操作复杂且逆转机制与原发型疾病不同。
- 物种差异： 啮齿类动物肝脏再生能力强，其纤维化形成和临床表现与人类存在一定差异（如人类肝硬化发展更慢、并发症更复杂）。
- 主要反映胆道疾病病理： 不能很好地模拟病毒性、酒精性、代谢性等其他病因导致的肝纤维化。
四、模型验证与应用
- 组织病理学评估（金标准）：
- H&E染色： 观察肝组织结构紊乱、肝细胞损伤/坏死/气球样变、胆管反应、炎性细胞浸润等情况。
- 胶原特异性染色（关键）： 天狼星红染色（偏振光下观察I型和III型胶原）或Masson三色染色是评估纤维化程度和分布的经典方法。可采用半定量评分系统（如Ishak、Metavir系统改良版）或数字化图像分析软件定量胶原面积百分比。
- 血清生化学检测：
- 肝损伤标志物：ALT, AST显著升高（急性期后AST/ALT比值常>1）。
- 胆汁淤积标志物：TBIL, DBIL（直接胆红素）, ALP, GGT显著持续升高。
- 肝功能指标：白蛋白（Alb）下降，凝血酶原时间（PT）延长。
- 分子生物学检测：
- 纤维化相关基因表达：I型胶原（Col1a1）、III型胶原（Col3a1）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、TGF-β1、TIMP-1等在肝脏组织中表达显著上调。
- 炎症因子基因表达或蛋白水平检测：TNF-α, IL-1β, IL-6, MCP-1等。
- 胆汁酸代谢相关基因表达变化。
- 羟脯氨酸含量测定： 定量检测肝脏组织内总胶原蛋白含量的金标准方法。
- 应用领域：
- 研究胆汁淤积性肝损伤、肝纤维化/肝硬化的发病机制（炎症、氧化应激、HSC活化、ECM代谢失衡等）。
- 评估抗炎、抗氧化、抗纤维化、利胆、促进胆管修复等药物的疗效和作用机制。
- 探索纤维化无创诊断生物标志物。
- 研究门静脉高压的形成机制及治疗。
总结
胆管结扎（BDL）模型通过模拟胆道梗阻，成功地、可重复地在实验动物（主要是大鼠）中诱发了进行性的胆汁淤积、肝损伤、炎症反应、肝星状细胞活化以及特征性的肝纤维化直至肝硬化。其病理进程与人类胆汁淤积性疾病相似，为深入研究该领域病理生理学基础及开发新的治疗策略提供了不可或缺的平台。尽管存在手术创伤、死亡率和物种差异等局限性，BDL模型因其强效性、可重复性和病理模拟性，仍是胆汁淤积性肝纤维化研究中最主流和应用最广泛的动物模型之一。研究者需严格遵循手术规范、完善镇痛护理、设立严谨对照，并综合利用多种检测手段来准确评估模型状态和研究终点。