Ⅱ型胶原诱导类风湿性关节炎(RA) 模型

发布时间：2025-07-01 08:01:52 阅读量：1 作者：生物检测中心

Ⅱ型胶原诱导关节炎（CIA）模型：研究类风湿性关节炎的关键工具

类风湿性关节炎（RA）是一种病因复杂的慢性自身免疫性疾病，以关节滑膜炎症、进行性软骨和骨破坏为特征。为了深入理解其发病机制并筛选有效治疗策略，建立可靠的动物模型至关重要。其中，Ⅱ型胶原诱导关节炎（Collagen-Induced Arthritis, CIA）模型因其与人类RA在病理和免疫学特征上高度相似，成为应用最广泛的实验模型之一。

一、 模型建立的核心机制

  1. 自身抗原：Ⅱ型胶原（CII）

    • CII是关节软骨的主要结构蛋白成分。
    • 在CIA模型中，外源性的同种或异种（通常为鸡或牛）CII被用作免疫原。

  2. 免疫应答启动

    • 初次致敏： 将溶解于酸性溶液中的CII，与等体积的完全弗氏佐剂（CFA） 充分乳化，形成油包水乳剂。CFA中的灭活分枝杆菌成分（如结核杆菌）是强效的免疫刺激剂，提供关键的“危险信号”。
    • 注射方式： 通常经皮下注射（如尾根部、背部多点）给与动物（最常用易感的DBA/1小鼠，因其携带H-2q单倍型）。
    • 佐剂作用： CFA促进抗原提呈细胞（如树突状细胞）摄取CII，迁移至引流淋巴结，激活初始T细胞。

  3. 自身免疫反应放大与致病

    • T细胞活化： 活化的CII特异性CD4+ T细胞（主要为Th1和Th17亚群）增殖分化，分泌促炎细胞因子（如IFN-γ, TNF-α, IL-17, IL-6）。
    • B细胞活化与自身抗体产生：
      • 活化的T细胞辅助B细胞。
      • B细胞分化为浆细胞，产生高水平的抗CII自身抗体（主要为IgG1和IgG2a/c亚型）。
    • 免疫复合物形成与炎症：
      • 自身抗体与关节软骨中的内源性CII结合，形成免疫复合物。
      • 免疫复合物沉积于关节滑膜，激活补体系统（C5a等）。
      • 活化的补体片段、Fc受体介导的效应细胞（如巨噬细胞、中性粒细胞）活化，释放大量促炎因子（TNF-α, IL-1β, IL-6）、趋化因子、基质金属蛋白酶（MMPs）和活性氧自由基（ROS）。
    • 炎症级联反应：
      • 这些介质共同作用，导致滑膜血管翳增生（滑膜衬里层细胞过度增殖）、炎性细胞浸润（中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞）、滑膜组织炎症。
      • 持续的炎症最终破坏关节软骨（蛋白聚糖丢失、胶原降解）和骨组织（破骨细胞活化导致骨侵蚀）。

  4. 表位扩散（Epitope Spreading）

    • 随着疾病进展，免疫反应可能从最初针对外源性CII的特定表位，扩展到针对自身内源性CII或其他关节成分（如XI型胶原、软骨寡聚基质蛋白COMP）的表位，导致慢性化和疾病恶化。
 

二、 标准的CIA模型建立方法

  1. 实验动物：

    • 首选： DBA/1雄性小鼠（6-10周龄）。雌性也可用，但发病率可能略低且波动稍大。
    • 其他易感品系： B10.RIII小鼠（H-2r）、某些转基因或基因敲除小鼠（需背景品系易感）。
    • 大鼠： Lewis大鼠或DA大鼠也可用于建立CIA，病程通常更快更猛烈。

  2. 试剂准备：

    • Ⅱ型胶原（CII）： 通常来源于鸡胸骨或牛关节软骨，溶解于低浓度的醋酸（如0.1M）或稀盐酸溶液中（如0.01M HCl），浓度通常为2-4 mg/ml（小鼠）或1-2 mg/ml（大鼠）。溶液需在4°C保存，避免反复冻融。
    • 完全弗氏佐剂（CFA）： 含有预定浓度的灭活分枝杆菌。注意：CFA的配制和使用需严格遵守生物安全规范。
    • 不完全弗氏佐剂（IFA）（用于加强免疫）： 不含分枝杆菌的油性佐剂。

  3. 乳化：

    • 将等体积的CII溶液与CFA在冰浴上充分混合乳化。乳化方法包括：
      • 使用两个连接注射器反复推拉（需小心操作）。
      • 使用专用的乳化设备（如转子-定子乳化仪）。目标是形成稳定的油包水（W/O）乳剂。判断标准：取一小滴滴于水面，应保持球形不扩散。

  4. 免疫程序（以小鼠为例）：

    • 初次免疫（Day 0）： 将乳化好的CII/CFA经皮下注射（SC）。常用注射部位包括尾根部（50μl）和背部（50μl x 2点），总量约150μl，含CII 100-200μg（具体剂量依据CII来源、纯度和预实验优化）。
    • 加强免疫（Day 21）： 将CII溶液（浓度同前）与等体积的IFA（不再是CFA）乳化。经皮下注射（通常只在尾根部或背部一处，50-100μl，含CII 50-100μg）。注意：加强免疫使用不含强免疫刺激物的IFA是为了避免过度强烈的局部反应和系统毒性。

  5. 疾病监测与评估：

    • 发病时间： 加强免疫后约7-10天（小鼠）或更早（大鼠）开始出现关节炎症状。
    • 临床评分（通常每日或隔日进行）：
      • 评估关节红肿程度。常用标准为对每只爪（前爪和后爪，共4只）进行评分：
        • 0分：无红肿。
        • 1分：轻微红肿和/或仅个别指/趾关节受累。
        • 2分：中度红肿和/或超过一个指/趾关节受累。
        • 3分：严重红肿累及整个爪子和踝/腕关节。
        • 4分：关节强直、变形或无法承重。
      • 每只动物总分范围为0-16分（4只爪x 4分）。
      • 同时记录发病率（出现关节炎的动物比例）。
    • 关节炎指数： 有时取所有动物评分的平均值。
    • 其他指标：
      • 足爪厚度测量： 使用卡尺测量踝关节或掌跖关节厚度，提供客观量化数据。
      • 体重变化： 关节炎活动期动物可能出现体重减轻。
      • 血清学检测： 取血分离血清，通过ELISA等方法检测抗CII抗体（总IgG及IgG1、IgG2a/c等亚型）水平，是重要的免疫反应指标。
      • 组织病理学（终点评估）： 处死动物，取踝关节或膝关节，固定、脱钙、石蜡包埋、切片、HE染色等。
        • 评估关键病理特征： 滑膜增生/炎症细胞浸润程度、血管翳形成、软骨破坏（蛋白聚糖丢失、表面侵蚀）、骨侵蚀（破骨细胞活性、骨破坏）。
        • 使用半定量评分系统对病理改变进行打分。
      • 显微计算机断层扫描（Micro-CT）： 提供高分辨率的三维骨结构图像，精确定量骨侵蚀体积、骨小梁结构参数（如骨体积分数BV/TV）以及骨赘形成（骨增生）情况。
      • 离体关节成像/组织学： 番红O/快绿染色可清晰显示软骨蛋白聚糖的丢失。
 

三、 CIA模型的主要优势

  1. 病理相似性高： 再现了人类RA的核心病理特征，包括滑膜炎、炎性细胞浸润（淋巴细胞、巨噬细胞、中性粒细胞）、血管翳形成、进行性软骨破坏和骨侵蚀。
  2. 自身免疫本质： 依赖于针对自身关节成分（CII）的T、B细胞自身免疫反应，产生致病性自身抗体（抗CII抗体），这与人类RA的自身免疫发病机制高度一致。
  3. 慢性化病程： 疾病一旦发生，通常呈慢性进行性发展，允许研究慢性炎症和关节破坏的机制。
  4. 对治疗的反应性： 模型对许多临床用于治疗RA的药物（如抗TNF-α抗体、抗IL-6R抗体、甲氨蝶呤、地塞米松、JAK抑制剂等）有良好反应，是临床前药物筛选和评价疗效及作用机制的理想平台。
  5. 方法相对标准化： 免疫方案、评估指标等有较成熟的参考流程，可在不同实验室间一定程度上重复。
 

四、 CIA模型的局限性

  1. 诱导性模型： 疾病由外源性抗原和强佐剂人工诱导，并非自发产生，与人类RA的病因不完全相同（人类RA病因不明）。
  2. 品系依赖性： 主要限于特定的遗传易感品系（如DBA/1），限制了在广泛遗传背景上的研究。
  3. 发病率和严重程度波动： 受CII批次质量、乳化效果、动物状态、环境等因素影响，发病率和严重程度可能存在一定批间差异。
  4. 佐剂相关的局部反应： CFA可引起注射部位强烈的局部炎症反应甚至溃疡。
  5. 关节炎分布的差异： 主要累及外周小关节（爪），而人类RA常累及手、腕、足等，也可累及大关节和颈椎。
  6. 类风湿因子（RF）和抗瓜氨酸化蛋白抗体（ACPA）： CIA模型中通常不产生RF和ACPA（人类RA的关键血清学标志物），尽管有报道在慢性期或特定改良模型中出现低水平RF。
 

五、 模型的重要应用价值

  1. RA发病机制研究：
    • 深入研究自身反应性T/B细胞的活化、迁移及致病机制。
    • 阐明细胞因子（TNF-α， IL-1β， IL-6， IL-17， IL-23等）、趋化因子网络在关节炎发生发展中的作用。
    • 探索滑膜增生、血管翳形成、软骨破坏和骨侵蚀的分子和细胞机制。
    • 研究遗传因素（如MHC II类分子）和环境因素（如微生物组）对疾病易感性的影响。
  2. 药物发现与评价：
    • 筛选候选化合物/生物制剂： 评估潜在治疗药物（小分子化合物、抗体、多肽、基因疗法等）对关节炎发生、发展和关节破坏的预防或治疗作用。
    • 验证药物靶点： 利用基因敲除/敲入小鼠或靶向抑制剂，在体验证特定靶点（如细胞因子、信号通路分子）在RA病理中的作用。
    • 研究药物作用机制（MOA）： 分析药物治疗后对免疫细胞亚群、细胞因子谱、自身抗体水平、病理改变等的影响。
    • 优化给药方案（剂量、途径、时间窗）： 确定最佳治疗策略。
  3. 生物标志物研究： 寻找与疾病活动度、关节破坏进展或治疗反应相关的血清、组织或影像学生物标志物。
  4. 个体化治疗探索： 结合不同遗传背景或特定基因修饰的模型，探索影响药物反应的遗传因素。
 

六、 模型评估要点总结

评估维度 关键指标
临床评估 关节炎发病率、临床评分（爪红肿）、足爪厚度、体重变化
血清学评估 抗CII自身抗体水平（总IgG及IgG1, IgG2a/c等亚型）
组织病理学评估 滑膜炎症/增生、血管翳形成、炎性细胞浸润、软骨破坏（蛋白聚糖丢失、表面侵蚀）、骨侵蚀
影像学评估 Micro-CT（骨侵蚀体积、骨赘形成、骨小梁结构参数）
分子/细胞机制 细胞因子谱、免疫细胞亚群分析（流式细胞术）、信号通路活化状态等

结论

Ⅱ型胶原诱导关节炎（CIA）模型以其与人类RA在病理特征（滑膜炎、血管翳、软骨/骨破坏）和自身免疫本质上的高度相似性，成为研究RA发病机制和筛选评价新型治疗策略不可或缺的临床前工具。尽管存在诱导性、品系限制性等局限性，其相对标准化的操作流程和对现有RA治疗药物的良好反应性，使其在阐明疾病机制、发现和验证新靶点、评估药物疗效与机制方面持续发挥核心作用。研究者通过细致规范的模型建立、严格的临床观察和多维度的终点分析（临床、血清学、组织病理学、影像学、分子细胞学），能够获得可靠的数据，为攻克类风湿性关节炎这一顽疾提供重要的科学基础。