破伤风类毒素(TTx) 诱导的延迟型过敏(DTH) 模型

破伤风类毒素 (TTx) 诱导的延迟型超敏反应 (DTH) 模型

摘要：
延迟型超敏反应 (DTH) 是体内评估细胞介导免疫应答的重要模型。本文详述了利用破伤风类毒素 (TTx) 在小鼠中建立标准化 DTH 模型的方法，涵盖原理、材料、操作步骤、结果评估及注意事项，为细胞免疫研究提供可靠工具。

一、引言
延迟型超敏反应 (DTH) 是 T 淋巴细胞介导的抗原特异性炎症反应，常在抗原暴露后 24-72 小时达高峰，表现为局部红肿硬结。该模型广泛应用于评估疫苗效力、自身免疫机制及免疫调节药物功能。破伤风类毒素 (TTx) 作为高度纯化、安全性强的标准抗原，可稳定诱导抗原特异性 CD4+ Th1 细胞应答，是建立 DTH 模型的理想选择。

二、模型原理
TTx 经皮下初次免疫后，被抗原呈递细胞摄取、加工并提呈给淋巴结 T 细胞，诱导抗原特异性 T 细胞（主要为 Th1）增殖分化。间隔 7-14 天后，于足垫或耳部注射相同抗原进行激发。局部聚集的抗原特异性 T 细胞释放 IFN-γ、TNF-α 等细胞因子，募集巨噬细胞等炎症细胞，引发局部血管扩张、渗出及组织水肿，形成典型 DTH 反应。

三、实验材料与方法

实验动物：
6-8 周龄近交系小鼠（如 C57BL/6、BALB/c），实验前动物房适应 ≥ 1 周。
主要试剂：
- 破伤风类毒素 (TTx)：注射级，溶于无菌 PBS。
- 弗氏完全佐剂 (CFA)：初次免疫时与 TTx 等体积乳化。
- 弗氏不完全佐剂 (IFA)：加强免疫时可选。
- 无菌磷酸盐缓冲液 (PBS)。
- 麻醉剂（如异氟烷）。
仪器设备：
- 电子游标卡尺或厚度测量仪（精度 0.01mm）。
- 无菌注射器（1ml）及针头（25-27G）。
- 乳化器（如涡旋混合器、双筒注射器）。
- 组织处理设备（固定、脱水、包埋、切片）。
- 光学显微镜。
实验步骤：
1. 致敏（初次免疫）：
  - 将 TTx（5-10 μg/鼠）与等体积 CFA 充分乳化（形成稳定油包水乳剂）。
  - 小鼠腹股沟或背部皮下注射 100 μl 乳化物。
2. 休整期：
  - 动物常规饲养 7-14 天，使抗原特异性 T 细胞活化增殖。
3. 激发（二次免疫）：
  - 轻度麻醉小鼠。
  - 于一侧后足足垫皮下注射 10-20 μl TTx（溶于 PBS，10-20 μg/鼠）。
  - 对侧足垫注射等量 PBS 作为阴性对照。
4. 反应监测：
  - 激发后 24 小时、48 小时（高峰期）及 72 小时，使用卡尺测量双足足垫厚度。
  - 计算肿胀度 = (激发侧足垫厚度 - 激发前厚度) - (对照侧足垫厚度 - 激发前厚度)（单位：mm）。
5. 组织学分析（可选）：
  - 激发后 24-48 小时安乐死小鼠，取足垫组织。
  - 4% 多聚甲醛固定 → 石蜡包埋 → 切片（5 μm）。
  - HE 染色观察炎症浸润（单核细胞、淋巴细胞聚集）。
  - 免疫组化染色分析特定细胞标记（如 CD3、F4/80）。

四、结果评估

足垫肿胀度： DTH 强度的核心指标。实验组显著高于 PBS 对照组表明模型成功建立（p < 0.05）。
组织病理学： HE 染色可见激发部位密集单核细胞浸润及组织水肿；免疫组化可识别 T 细胞、巨噬细胞浸润。
炎症因子检测（可选）： 取足垫组织研磨液或血清，检测 IFN-γ、TNF-α 水平（ELISA）进一步验证 Th1 应答。

五、注意事项

抗原乳化： CFA/TTx 乳化须充分稳定，避免注射后快速扩散（乳滴置水面不散开为佳）。
注射技巧： 足垫注射需精准皮下，避免注入皮内或肌肉层损伤组织。
测量准确性： 固定测量位置、力度及操作者，减小人为误差。
动物福利： 足垫肿胀可能导致疼痛，密切监控动物状态，必要时及时干预。
伦理合规： 所有操作须经机构动物伦理委员会批准。

六、应用领域

疫苗开发： 评价疫苗诱导细胞免疫应答的能力。
免疫调节剂研究： 筛选增强或抑制细胞免疫的药物/化合物。
自身免疫机制： 研究 Th1/Th17 细胞在组织损伤中的作用。
基础免疫学： 探讨 T 细胞活化、迁移及效应机制。

七、结论
TTx 诱导的 DTH 模型操作规范、结果稳定、重复性高，通过客观测量足垫肿胀度及组织病理学分析，可有效量化抗原特异性 T 细胞应答水平，是评估细胞免疫功能的经典实验模型。严格控制实验条件及遵守动物伦理规范是获取可靠数据的关键。

参考文献
(此处应列出相关的经典方法学论文及原理研究文献)

本模型说明严格遵循学术规范编写，省略了商业产品名称，着重突出实验原理与标准化操作流程，可作为细胞免疫研究的基础实验指南。