东莨菪碱/低湿环境诱导的干眼症模型

东莨菪碱联合低湿环境诱导干眼症动物模型构建方案

一、 引言
干眼症是一种以泪膜稳态失衡为核心，伴随眼部不适、视力障碍的常见眼表疾病。建立稳定可靠的动物模型对于深入理解其发病机制及开发新型疗法至关重要。东莨菪碱（一种非选择性毒蕈碱型乙酰胆碱受体拮抗剂）通过抑制泪腺分泌，联合可控低湿环境加速泪液蒸发，可高效模拟人类干眼症的关键病理生理特征——泪液分泌不足与蒸发过强。

二、 模型优势

• 操作简便： 无需复杂手术，技术难度低。
• 周期较短： 造模时间相对较短（通常数天至2周）。
• 可重复性好： 实验条件和操作易于标准化。
• 模拟性强： 同时再现泪液分泌减少（药物诱导）和蒸发增加（环境诱导）两大核心机制。
• 指标明确： 眼部症状及泪膜相关指标变化显著且易于检测。

三、 实验材料

1. 实验动物： 常用SPF级C57BL/6小鼠或SD大鼠（6-8周龄）。小鼠需适应环境至少3天后开始实验。
2. 主要试剂：
   • 氢溴酸东莨菪碱注射液（常用浓度为0.5-1.0 mg/mL，溶于无菌生理盐水或PBS）。
   • 无菌生理盐水或PBS（用作溶剂对照）。
   • 1% 荧光素钠染色液。
   • 酚红棉线（用于Schirmer I试验，可选）。
   • 麻醉剂（如腹腔注射水合氯醛）。
3. 主要仪器设备：
   • 可控低湿环境箱（可将相对湿度精确控制在15-30% RH，温度维持22-25°C，可安装风扇促进空气流通）。
   • 裂隙灯生物显微镜（配备钴蓝光及黄色滤光片）。
   • 小动物眼压计（可选，测量非接触式眼压）。
   • 精密电子天平。
   • 微量注射器（如胰岛素注射器）。
   • 计时器。
   • 动物体重秤。

四、 模型构建方法

1. 动物分组与标记： 随机将动物分为模型组和对照组（每组建议至少6只）。清晰标记动物（耳标或尾部标记）。
2. 药物注射诱导：
   • 模型组： 颈部或背部皮下注射氢溴酸东莨菪碱溶液。
     • 小鼠剂量： 0.5 mg/100g 体重/次（例如：体重25g小鼠注射0.125mg/25μL）。
     • 大鼠剂量： 1.0 mg/100g 体重/次。
     • 注射频率： 每日注射4次（如8:00， 12:00， 16:00， 20:00），注射间隔约4小时。
   • 对照组： 相同注射途径、体积和频率注射等量无菌生理盐水或PBS。
   • 注射周期： 通常连续注射4-7天。注射部位需轮换以防局部刺激。
3. 低湿环境暴露：
   • 在开始药物注射的同时，将模型组动物置于可控低湿环境箱中（相对湿度15-30% RH）。
   • 动物可自由饮水摄食。
   • 暴露时间： 每天持续暴露于低湿环境中16-18小时（模拟白天活动期），剩余时间（如夜间）可移回正常湿度（50-60% RH）的标准饲养笼中休息。总环境暴露周期与药物注射周期一致（4-7天）。
   • 对照组： 除药物注射生理盐水外，始终饲养于标准湿度（50-60% RH）环境中。
4. 强制干燥期（可选，增强模型）：
   • 在每次进行泪液分泌功能测试（如Schirmer I试验）前，可将动物（特别是模型组）置于有柔和气流的低湿环境中（或使用小型风扇近距离吹拂眼表）15-30分钟，加速表面泪液蒸发，使眼表处于更干燥的状态，以获得更稳定显著的测试结果。

五、 模型评估指标
通常在造模结束时进行各项检测：

1. 泪液分泌量检测（Schirmer I 试验）：
   • 动物麻醉后（如腹腔注射水合氯醛）。
   • 将标准化宽度的酚红棉线一端轻柔弯折，小心放置于动物下眼睑中外1/3处的结膜囊内。
   • 计时5分钟。
   • 取出棉线，测量被泪液浸湿的长度（毫米，mm）。模型组数值显著低于对照组。
2. 角膜上皮损伤评估（荧光素钠染色）：
   • 向眼表滴入1-2 μL 1% 荧光素钠溶液。
   • 轻柔闭合眼睑数次使染料均匀分布。
   • 1-2分钟后，在裂隙灯生物显微镜钴蓝光激发下观察，使用黄色滤光片增强对比。
   • 评分标准（示例）： 将角膜划分为4个象限。
     • 0分：无染色。
     • 1分：散在点状染色（<5个点/象限）。
     • 2分：点状染色较多（5-10个点/象限）或少量融合斑点。
     • 3分：密集点状染色（>10个点/象限）或片状融合染色。
     • 4分：大面积融合染色或溃疡形成。
   • 四个象限分数相加得到总分（0-16分）。模型组总分显著高于对照组。
3. 泪膜破裂时间测量：
   • 荧光素钠染色后（方法同上）。
   • 在裂隙灯钴蓝光下，嘱动物（或轻柔使其）保持最后一次瞬目后的睁眼状态。
   • 从最后一次完全瞬目开始计时，观察到角膜表面首次出现随机分布的干燥斑点（泪膜破裂点）的时间即为泪膜破裂时间（单位：秒，s）。
   • 重复测量3次，取平均值。模型组泪膜破裂时间显著短于对照组。
4. 眼表炎症观察：
   • 在裂隙灯白光下观察球结膜充血、水肿（睫状充血、结膜水肿）程度。
   • 可进行半定量评分（如：0=无，1=轻度，2=中度，3=重度）。
5. 体重监测： 定期称重，观察药物（东莨菪碱）是否引起明显的全身性副作用（如体重显著下降）。
6. 组织病理学（验证性）：
   • 造模结束后可取眼球及附属腺体（泪腺、副泪腺）标本。
   • 常规石蜡切片，HE染色观察角膜、结膜上皮结构完整性、杯状细胞密度，泪腺腺泡及导管结构有无萎缩、炎症细胞浸润等。

六、 注意事项

1. 动物福利伦理： 实验操作需严格遵守动物实验伦理规范。药物注射、环境暴露、眼部检查等操作需轻柔，尽量减少动物痛苦。必要时使用麻醉剂。发现动物严重不适（如角膜溃疡穿孔、体重急剧下降>20%等）应立即终止实验并实施人道措施。
2. 湿度控制： 低湿环境箱的湿度必须精确控制和维持。定期校准湿度计。
3. 光照与通风： 环境箱内应提供适当光照周期（如12小时光照/12小时黑暗）和温和的空气流通（避免强风直吹动物面部引起不适）。
4. 药物剂量与注射： 严格控制东莨菪碱浓度及注射剂量，过量可能导致严重副作用（如心动过速、呼吸抑制）。注射部位轮换，注意无菌操作。
5. 对照组设置： 必须设立严格的对照组（生理盐水注射 + 正常湿度环境），以排除操作和环境因素本身的影响。
6. 操作一致性： 药物注射、环境暴露时间长度、各项检测的操作者及评分标准应尽量保持一致，由经过培训的人员操作，以减少主观误差。
7. 模型稳定性： 该模型表型在停止药物和环境刺激后可能逐渐恢复。如需长期模型，需持续维持刺激或探索延长方案。

七、 结语
东莨菪碱皮下注射联合低湿度环境暴露是一种成熟、高效、可靠的非手术性干眼症动物模型构建方法。它通过药理学阻断泪液分泌和物理环境加速泪液蒸发，成功模拟了干眼症的核心病理特征。该模型操作相对简便，周期较短，重复性好，表型指标明确（泪液分泌减少、泪膜破裂时间缩短、角膜上皮损伤），是研究干眼症发病机制、病理生理过程及筛选评价新型治疗方法（如人工泪液、促分泌药物、抗炎药物、物理治疗等）的有力工具。研究者需严格遵循操作规范，关注动物福利，确保实验结果的科学性和可靠性。

重要声明： 本文内容仅供参考，具体实验方案的设计与实施应严格遵循所在机构的相关规定及动物伦理委员会审批。实验操作涉及动物，务必以最高的伦理标准和动物福利为准则。