补体激活试验模型 - 中析研究所生物检测中心

补体激活试验模型：探索免疫防御的关键机制

补体系统是人体固有免疫的核心组成部分，由30余种血浆蛋白构成，形成精密的多级联酶促反应网络。其主要功能包括：直接裂解病原体（形成膜攻击复合物MAC）、调理吞噬作用（标记病原体促进吞噬）、清除免疫复合物和凋亡细胞、以及调节适应性免疫反应。检测补体的激活状态和功能活性对于理解感染、自身免疫病（如系统性红斑狼疮SLE、类风湿关节炎RA）、某些肾脏疾病、遗传性补体缺陷以及评估移植排斥风险等至关重要。

补体激活主要有三条途径：

经典途径 (Classical Pathway, CP): 由抗原-抗体（IgG或IgM）复合物触发，C1q识别复合物启动级联。
凝集素途径 (Lectin Pathway, LP): 由病原体表面特定的糖结构（如甘露糖）激活，甘露糖结合凝集素（MBL）或纤维胶凝蛋白（Ficolin）识别启动。
替代途径 (Alternative Pathway, AP): 不依赖于抗体，由微生物表面成分（如脂多糖LPS）或其他激活物直接激活C3，形成放大环路。

针对每条途径，科学家们开发了特定的试验模型进行检测和定量分析：

一、经典途径激活试验模型

溶血试验 (Hemolytic Assay - CH50)：
- 原理： 这是最经典的功能性检测方法，用于评估补体整体溶解靶细胞的能力。将待测血清（含补体）与预先敏化（包被了抗红细胞抗体，通常是兔抗绵羊红细胞抗体）的绵羊红细胞混合。补体经典途径被抗原-抗体复合物激活，最终形成MAC，导致绵羊红细胞裂解（溶血）。
- 检测与量化： 通过分光光度计测量反应后上清液中血红蛋白的释放量（OD值），反映溶血程度。
- 关键指标 - CH50单位： 定义为导致50%标准敏化绵羊红细胞发生溶血所需的最小血清量。CH50值降低提示经典途径功能缺陷（如遗传缺陷、消耗增加），升高则意义不大。
- 特点： 反映经典途径整体功能活性终点（MAC形成能力），是评估经典途径活性的金标准之一。但受多种因素影响，如血清采集和处理条件。
酶联免疫吸附试验 (ELISA)：
- 原理： 利用特异性抗体检测补体活化过程中产生的特定裂解片段或复合物。
- 常用靶标：
  - C4d: 经典/凝集素途径活化时C4裂解的稳定片段。检测C4d（如沉积在组织或循环中）是经典/凝集素途径激活的敏感标志物（如移植排斥、自身免疫病）。
  - C1q结合试验： 检测血清中C1q与循环免疫复合物（CIC）结合的能力，间接反映经典途径激活状态。
  - 特异性复合物： 如检测特异性靶向经典途径激活抗原（如dsDNA）的免疫复合物所固定的补体成分（C3d, C4d）。
- 特点： 敏感性高，可定量，能检测特定活化产物而非整体功能，可用于大规模筛查。但反映的是特定片段的水平，需结合功能试验判断通路完整性。

二、凝集素途径激活试验模型

MBL依赖性C4激活试验：
- 原理： 利用包被在固相载体（如微孔板）上的富含甘露糖的分子（如酵母聚糖甘露聚糖），模拟病原体表面。加入待测血清后，MBL与甘露糖结合，激活相关的丝氨酸蛋白酶(MASP-1, MASP-2)，进而裂解随后加入的底物C4。
- 检测与量化： 通过检测裂解的C4片段（如使用抗C4c抗体）来定量凝集素途径的激活能力。
- 特点： 直接检测MBL依赖的凝集素途径功能活性。可检测MBL功能缺陷（遗传或获得性）。
MBL/Ficolin水平测定 (ELISA)：
- 原理： 使用特异性抗体直接检测血清中MBL或Ficolin蛋白的浓度。
- 特点： 操作简便常用。但仅反映蛋白浓度，不能直接反映功能活性。低浓度常伴随功能降低，但功能正常但浓度低（罕见突变引起蛋白功能障碍）或浓度正常但功能低下（如获得性抑制物）的情况也可能存在。
凝集素途径特异性ELISA：
- 原理： 类似于经典途径ELISA，检测凝集素途径活化产物。更特异的靶标是：
  - LP激活标志物： 如MBL与特定病原体模式的结合复合物。
  - MASP-2活性/水平： MASP-2是启动C4裂解的关键酶。
- 特点： 特异性强，有助于明确通路激活状态。

三、替代途径激活试验模型

替代途径溶血试验 (APH50)：
- 原理： 类似于CH50，但使用未敏化的特定动物红细胞（如兔红细胞、豚鼠红细胞或人红细胞）。这些红细胞表面缺乏补体调节蛋白（如CD55, CD59），或者在高浓度镁离子和乙二醇双（β-氨基乙基醚）四乙酸（EGTA）存在的缓冲液中（EGTA螯合钙离子抑制经典/凝集素途径），替代途径可被自发激活或由兔红细胞激活，导致红细胞裂解。
- 检测与量化： 同样测量血红蛋白释放量。
- 关键指标 - APH50单位： 导致50%兔红细胞发生溶血所需的最小血清量。APH50降低提示替代途径功能缺陷。
- 特点： 反映替代途径整体功能活性终点（MAC形成能力），是评估替代途径的金标准之一。
替代途径活化产物检测 (ELISA)：
- 原理： 检测替代途径特异性的活化产物。
- 主要靶标：
  - Bb片段： 替代途径活化时，因子B被裂解产生Bb片段，是替代途径激活的特异性标志物（如阵发性睡眠性血红蛋白尿PNH）。
  - C3a, C5a： 强效过敏毒素，所有途径激活均可产生，但在替代途径激活性疾病（如C3肾小球病）中显著升高。
  - SC5b-9 (soluble MAC, sC5b-9)： 补体激活最终形成的可溶性膜攻击复合物，反映末端通路的活化强度，可用于多种补体激活相关疾病监测。
- 特点： 敏感度高，能反映体内活化程度，是疾病活动和治疗监测的重要指标。

应用与挑战

临床应用：
- 诊断： 筛查先天性补体缺陷（CH50/APH50显著降低或为零）；辅助诊断自身免疫病（SLE中低补体C3、C4及升高的活化产物如C3a、C5a、SC5b-9）；诊断和监测补体介导的肾脏疾病（如C3肾小球病、非典型溶血尿毒综合征aHUS）；评估移植排斥（移植物组织活检中C4d、C3d沉积，循环SC5b-9）。
- 治疗监测： 靶向补体治疗药物（如抗C5单抗依库珠单抗）的疗效和安全性监测（监测CH50活性、SC5b-9水平）。
研究应用： 阐明疾病发病机制；评估新药对补体系统的抑制效果；研究病原体免疫逃逸机制。
挑战与展望：
- 标准化： 不同类型实验室间结果可比性仍需提高，尤其是溶血试验。
- 样本稳定性： 补体蛋白（尤其功能）易在体外降解，对样本采集、运输和储存要求严格（一般需-80°C保存或新鲜快速检测）。
- 解读复杂性： 结果需结合临床背景、其他检测指标（如自身抗体、肾功能）综合判断。功能试验（CH50/APH50）反映通路完整性，产物检测（ELISA）反映活化程度。
- 新兴技术： 微流控芯片、多重质谱分析等新技术有望提高检测通量、灵敏度和特异性，提供更全面的补体激活谱信息。

结论

补体激活试验模型是揭示免疫稳态和疾病机制不可或缺的工具。从传统的功能溶血试验（CH50, APH50）到高灵敏度的特定活化产物检测（如C3a, C5a, SC5b-9, Bb, C4d），这些模型为临床诊断、治疗监测和基础研究提供了多维度信息。理解不同模型的原理、优缺点和应用场景，对于准确评估补体系统状态至关重要。随着技术的进步和对补体系统认识的深入，更精准、便捷的检测方法将不断涌现，进一步推动补体相关疾病的精准诊疗。

参考文献与延伸阅读建议（格式示例）：

Ricklin D, Hajishengallis G, Yang K, Lambris JD. Complement: a key system for immune surveillance and homeostasis. Nat Immunol. 2010;11(9):785-797.
Würzner R. Modulation of complement membrane attack by local C7 synthesis. Clin Exp Immunol. 2000;121(1):8-10. (讨论C7合成对MAC的影响)
Roumenina LT, Rayes J, Frimat M, Fremeaux-Bacchi V. Endothelial cells: source, barrier, and target of defensive mediators. Immunol Rev. 2016;274(1):307-329. (讨论内皮细胞在补体相关疾病中的作用)
Merle NS, Church SE, Fremeaux-Bacchi V, Roumenina LT. Complement System Part I - Molecular Mechanisms of Activation and Regulation. Front Immunol. 2015;6:262.
Merle NS, Noe R, Halbwachs-Mecarelli L, Fremeaux-Bacchi V, Roumenina LT. Complement System Part II: Role in Immunity. Front Immunol. 2015;6:257.
《临床免疫学检验技术》(人民卫生出版社出版教材)，相关章节通常详细描述补体检测原理与方法学评价。

这篇综述提供了补体激活试验模型的核心框架，重点强调了科学原理与应用价值，完全避免了任何可能涉及商业利益的具体品牌信息。