HFD+Angll诱导的小鼠HFpEF模型 - 中析研究所生物检测中心

HFD联合AngII诱导小鼠HFpEF模型构建方案

摘要：
射血分数保留型心力衰竭（HFpEF）已成为全球主要健康负担，其病理生理机制复杂，涉及代谢紊乱、炎症激活、微血管功能障碍及心肌纤维化等多因素交织。高脂饮食（HFD）联合血管紧张素II（AngII）持续输注是当前广泛应用的HFpEF小鼠模型构建方法，能较好模拟人类HFpEF的核心特征。本文详细介绍该模型的构建原理、操作流程、表型特征、验证指标及注意事项，为心血管疾病基础研究提供技术参考。

一、模型构建原理

该模型通过双重病理刺激模拟人类HFpEF发病环境：

代谢应激 (HFD)： 长期高脂饮食诱发肥胖、胰岛素抵抗、血脂异常及慢性低度炎症，模拟HFpEF常见的代谢合并症。
神经内分泌/血流动力学应激 (AngII)： 持续输注AngII激活肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS），导致持续性高血压、心肌肥厚、心肌纤维化及内皮功能障碍。

两种刺激协同作用，共同促进心肌僵硬、舒张功能障碍及运动耐量下降，形成HFpEF表型。

二、材料与方法

实验动物：
- 常用8-12周龄雄性C57BL/6J小鼠（对代谢及高血压刺激敏感）。
- 饲养于SPF级环境，标准光照周期（12小时明/12小时暗），自由饮水。
- 实验前适应性饲养至少1周。
- 伦理声明： 所有操作严格遵循实验动物福利伦理委员会批准。
试剂与设备：
- 高脂饮食 (HFD)： 脂肪热量占比60%的标准化饲料。
- 血管紧张素II (AngII)： 溶解于生理盐水或含0.01M醋酸/0.1% BSA的生理盐水中。
- 微型渗透压泵 (Alzet)： 型号选择根据实验周期（常用型号2004，持续输注28天）。
- 异氟烷麻醉系统、手术器械（无菌）、缝合线。
- 无创尾套血压测量系统。
- 超声心动图仪（配备高频探头）。
- 代谢笼系统（可选，用于评估运动耐量）。
- 组织处理设备（固定、脱水、包埋、切片）。
- 相关生化检测试剂盒（血糖、胰岛素、血脂谱）。
- 组织学染色试剂（H&E, Masson’s Trichrome, Picrosirius Red, CD31/PECAM-1等抗体）。
- RNA/DNA/蛋白提取及分析设备。
模型构建流程：
- 阶段1：饮食诱导代谢紊乱 (通常4-8周)
  - 小鼠随机分为两组：HFpEF模型组 (HFD+AngII) 与 对照组 (正常饮食或正常饮食+生理盐水输注)。
  - 模型组给予HFD饲料，对照组给予标准维持饲料。
  - 每周监测体重。
  - 定期进行葡萄糖耐量试验（GTT）和胰岛素耐量试验（ITT）以评估胰岛素抵抗程度（可选）。
- 阶段2：AngII输注诱导持续高血压与心肌应激 (通常4周)
  - HFD喂养4-8周后，模型组和对照组（若设计有AngII对照）进行微型渗透压泵植入手术。
  - 手术操作 (无菌条件下，异氟烷麻醉)：
    1. 背部剃毛消毒。
    2. 背部肩胛骨间做约1cm切口。
    3. 钝性分离皮下组织形成囊袋。
    4. 将预先填充好AngII溶液（浓度常为1000-1500 ng/kg/min）或生理盐水（对照组）的泵植入囊袋。
    5. 缝合皮肤切口。
  - 术后给予镇痛药，密切观察恢复情况。
  - 对照组：
    - 可设置：正常饮食+生理盐水泵（ND+Saline）、HFD+生理盐水泵（HFD+Saline）、正常饮食+AngII泵（ND+AngII）。根据研究目的选择。
    - 关键对照组： ND+Saline（基础状态）和 HFD+Saline（评估HFD单独作用）。
- 阶段3：表型评估与取材 (AngII输注4周后)
  - 在AngII输注结束前/时进行终点评估：
    1. 无创血压： 测量收缩压、舒张压、平均动脉压。
    2. 超声心动图： 评估心脏结构与功能（重点舒张功能）。
    3. 运动耐量测试： 跑台或转棒实验评估运动能力。
    4. 血流动力学检测 (可选，需开胸)： 左心室导管插入术直接测量左室舒张末压（LVEDP）、时间常数τ（tau）、dP/dt min等。
  - 麻醉状态下采集血液样本：用于检测血糖、胰岛素、血脂、炎症因子（如IL-6, TNF-α）等。
  - 快速取出心脏、肺脏、肝脏、附睾脂肪等组织：
    - 称重（心脏、肺、肝脏、体重计算心体比、肺体比、肝体比）。
    - 心脏组织分装：部分液氮速冻后-80℃保存（分子生物学），部分福尔马林固定（组织学），部分OCT包埋（冰冻切片）。
    - 肺组织用于评估肺充血（湿/干重比）。
    - 脂肪组织用于评估脂肪量及炎症。

三、表型特征与验证指标

代谢表型 (HFD诱导成功)：
- 显著体重增加，肥胖（附睾脂肪垫增大）。
- 高血糖、高胰岛素血症、胰岛素抵抗（GTT/ITT异常，HOMA-IR指数升高）。
- 血脂异常（高甘油三酯、高胆固醇）。
- 脂肪组织炎症（巨噬细胞浸润增多，促炎因子表达升高）。
心血管表型 (HFpEF核心特征)：
- 高血压： 收缩压和平均动脉压持续显著升高。
- 心肌肥厚：
  - 超声： 左室壁增厚（IVSd, LVPWd），左室质量（LVM）增加。
  - 大体： 心体比（HW/BW）显著升高。
  - 组织学 (H&E)： 心肌细胞横截面积增大。
- 舒张功能障碍 (核心)：
  - 超声：
    - 二尖瓣血流：E/A比值降低，E峰减速时间（DT）延长。
    - 组织多普勒：二尖瓣环侧壁/间隔e'速度降低，E/e'比值显著升高（最常用、最可靠的超声指标）。
    - 左房容积指数（LAVI）增大（反映慢性舒张功能不全）。
  - 血流动力学 (金标准)： 左室舒张末压（LVEDP）显著升高；等容舒张期时间常数τ（tau）延长；dP/dt min（负向变化率）绝对值降低。
- 收缩功能保留：
  - 超声： 左室射血分数（LVEF）、左室短轴缩短率（LVFS）正常或轻度降低（通常保持>50%）。
  - 血流动力学： 左室收缩末压（LVESP）、dP/dt max正常或轻度改变。
- 肺充血： 肺湿/干重比（W/D）显著升高（反映左房压升高导致液体渗出）。
- 运动耐量下降： 跑台时间/距离显著缩短，转棒停留时间显著缩短。
组织病理学改变：
- 心肌纤维化：
  - 组织学染色 (Masson’s Trichrome, Picrosirius Red)： 心肌间质和血管周围胶原沉积显著增加（蓝色或红色区域面积增加）。
  - 分子生物学： 心肌组织Collagen I, Collagen III, TGF-β, CTGF等基因和蛋白表达上调。
- 心肌炎症浸润： 心肌组织巨噬细胞（如F4/80+, CD68+）、T细胞浸润增多，促炎因子（TNF-α, IL-1β, IL-6）表达升高。
- 微血管稀疏/内皮功能障碍：
  - 免疫组化 (CD31/PECAM-1)： 单位面积心肌微血管密度降低。
  - 分子生物学： eNOS表达或活性降低，ET-1表达升高。

四、模型优势与局限性

优势：
1. 能同时模拟HFpEF的代谢（肥胖、胰岛素抵抗）和血流动力学（高血压）两大核心诱因。
2. 诱导的表型相对全面：舒张功能不全（E/e'↑, LVEDP↑）、心肌肥厚、纤维化、炎症、微血管稀疏、运动耐量下降，且EF保留。
3. 造模周期相对可控（总约8-12周）。
4. 在C57BL/6小鼠上可重复性较好。
局限性：
1. 无法完全模拟人类HFpEF的老年化、性别差异（常用雄性小鼠）及长期慢性演变过程。
2. AngII诱导的高血压程度可能较剧烈。
3. 对肾功能的潜在影响需关注。
4. 不同实验室在HFD喂养时长、AngII剂量、小鼠周龄等方面可能存在差异，影响表型一致性。

五、关键注意事项

剂量与时间优化： AngII剂量（常用1000-1500 ng/kg/min）和HFD喂养时间（4-8周）需根据实验目的和动物品系进行预实验摸索，以达到稳定且可重复的HFpEF表型（重点是舒张功能不全和EF保留）。
严格对照组设置： 必须设立合适的对照组（ND+Saline, HFD+Saline, ND+AngII），以区分HFD和AngII各自的作用以及二者的协同效应。
舒张功能评估是核心： 务必通过超声（E/e'）和/或有创血流动力学（LVEDP）确认舒张功能障碍的存在，且EF>50%，这是判断HFpEF模型成功与否的关键。 仅凭心肌肥厚或纤维化不足以诊断HFpEF。
代谢表型验证： 需通过体重、脂肪量、GTT/ITT等指标确认HFD成功诱导了肥胖和胰岛素抵抗。
动物福利： 密切监测AngII输注后小鼠状态（血压过高可能导致不适），及时干预。严格遵循3R原则。
无菌操作： 植入泵手术需严格无菌，避免感染影响实验结果和动物健康。
样本处理： 取材过程迅速规范，确保组织样本质量满足后续检测要求。

结论：

HFD联合AngII持续输注是构建小鼠HFpEF模型的可靠方法，能够有效模拟该疾病的核心病理生理特征，包括代谢紊乱、高血压、左室肥厚、心肌纤维化、炎症、微血管功能障碍以及最重要的舒张功能不全伴射血分数保留。成功构建该模型的关键在于对饮食干预时间、AngII剂量、手术操作的精细控制，以及对舒张功能（E/e'或LVEDP）和射血分数（EF）的严格检测和确认。该模型为深入探究HFpEF的发病机制及潜在治疗靶点提供了重要的临床前研究工具。

（本文仅提供科研方法学参考，不涉及任何具体产品或商业实体）