冠脉永久结扎联合高脂饮食诱导载脂蛋白E基因敲除小鼠慢性心力衰竭模型：构建与评价
摘要：
慢性心力衰竭（CHF）是多种心血管疾病的终末阶段，其病理生理机制复杂。为更全面地模拟人类缺血性心肌病合并代谢紊乱导致的心衰进程，本研究结合冠脉永久结扎术与高脂饮食（HFD）喂养，在载脂蛋白E基因敲除（ApoE-KO）小鼠上成功构建了一种新型慢性心衰模型。该模型整合了心肌缺血损伤、持续血流动力学超负荷、动脉粥样硬化加速以及脂质代谢紊乱等多重病理因素，显著促进了左心室重构、功能障碍及神经内分泌激活，呈现出与人类慢性缺血性心衰高度相似的病理特征，为深入研究心衰机制及干预策略提供了更贴近临床的有效工具。
引言：
慢性心力衰竭是一种高发病率、高死亡率的临床综合征，缺血性心脏病是其最主要的病因。单纯冠脉结扎模型能模拟心肌梗死后心衰，但常需较长时间（常需8周以上）才能形成稳定的慢性心衰表型，且缺乏常见的代谢合并症。ApoE-KO小鼠因缺乏载脂蛋白E，血浆胆固醇清除障碍，在高脂饮食诱导下可快速形成严重的动脉粥样硬化。将冠脉永久结扎（造成不可逆心肌缺血损伤和持续性心脏负荷增加）与ApoE-KO小鼠的高脂饮食喂养相结合，旨在：1) 加速心肌梗死后左心室不良重构进程；2) 模拟临床常见的冠心病合并血脂异常背景；3) 在相对短的时间内（通常4-8周）诱导出更显著的慢性心衰表型。
材料与方法：
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实验动物：
- 选用雄性ApoE-KO小鼠（8-10周龄）。
- 对照组：假手术+ApoE-KO小鼠+普通饮食。
- 实验组：冠脉永久结扎术+ApoE-KO小鼠+HFD（脂肪供能比通常为45%或60%）。
- 所有动物饲养于标准SPF环境，自由饮水摄食。实验方案经动物伦理委员会审批。
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冠脉永久结扎手术（心肌梗死模型）：
- 小鼠麻醉（如异氟烷吸入），气管插管连接小动物呼吸机。
- 左侧开胸，暴露心脏。
- 在左心耳下缘与肺动脉圆锥之间，使用精细缝合线（如7-0或8-0）永久结扎左冠状动脉前降支（LAD）近端。
- 肉眼观察左心室前壁变苍白表明结扎成功。
- 逐层缝合胸腔和皮肤。假手术组仅穿线不结扎。
- 术后保温、镇痛，密切监护至苏醒。
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高脂饮食（HFD）诱导：
- 手术恢复期（通常1周）后，实验组小鼠开始饲喂高脂饲料（脂肪含量高，胆固醇含量通常为1.0-1.25%）。
- 对照组小鼠继续饲喂普通维持饲料。
- 持续喂养至实验终点（通常为术后4-8周）。
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模型评价指标：
- 生存率： 记录术后及HFD喂养期间的死亡率。
- 心脏结构与功能：
- 超声心动图： 终点时检测左心室射血分数（LVEF）、左心室短轴缩短率（LVFS）、左心室舒张末期内径（LVEDD）、左心室收缩末期内径（LVESD）、左心室质量（LVMass）、E/A比值等。
- 血流动力学： 终点时通过心导管术检测左心室收缩末压（LVESP）、左心室舒张末压（LVEDP）、左心室内压最大上升/下降速率（±dp/dt max）等。
- 心室重构与病理学：
- 心脏重量指数： 处死小鼠后称取体重（BW）、心脏重量（HW）、肺重量（LW），计算HW/BW、LW/BW。
- 组织形态学： 心脏组织经固定、石蜡包埋、切片后，进行：
- 苏木素-伊红（H&E）染色： 观察心肌细胞形态、排列、炎性浸润。
- 马松（Masson）三色染色/天狼星红（Sirius Red）染色： 定量分析心肌梗死面积（瘢痕组织）及心肌间质纤维化程度（胶原沉积）。
- 油红O染色/脂质组学： （可选）评估心肌或主动脉根部脂质沉积情况。
- 主动脉粥样硬化斑块： 分离主动脉（尤其主动脉根部），油红O染色定量斑块面积。
- 心衰生物标志物：
- 血浆/心肌组织匀浆中B型利钠肽（BNP）或N末端B型利钠肽原（NT-proBNP）水平（ELISA）。
- 心肌组织中心房利钠肽（ANP）、脑利钠肽（BNP）mRNA表达水平（qRT-PCR）。
- 神经内分泌激活：
- 血浆肾素活性（PRA）、血管紧张素II（Ang II）、醛固酮（Ald）水平（ELISA/RIA）。
- 心肌组织肾素-血管紧张素系统（RAS）关键组分（如ACE, AT1R）的表达（qRT-PCR/Western blot）。
- 代谢指标： 终点时检测血浆总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、血糖等。
结果：
- 生存率： 冠脉结扎联合HFD组小鼠在术后及HFD喂养期间死亡率显著高于假手术组或单纯冠脉结扎+普通饮食组，更贴近临床心衰患者的高死亡率特点。
- 心功能严重受损： 与对照组及单纯冠脉结扎组相比，联合模型组小鼠表现出：
- 显著降低的LVEF和LVFS。
- 显著扩大的LVEDD和LVESD。
- 显著增加的LVMass（提示心肌肥厚）。
- 显著升高的LVEDP和降低的±dp/dt max，以及异常的E/A比值（提示舒张功能不全）。
- 心室重构与病理改变加剧：
- HW/BW、LW/BW显著升高，提示心脏肥厚和肺淤血（心衰特征）。
- 心肌梗死面积显著大于单纯冠脉结扎组（可能与HFD加重缺血损伤或影响侧支循环有关）。
- 心肌间质纤维化程度（胶原容积分数）显著增加。
- 主动脉根部粥样硬化斑块面积显著增大。
- 心衰标志物显著升高： 血浆BNP/NT-proBNP水平、心肌ANP/BNP mRNA表达在联合模型组中均显著上调。
- 神经内分泌系统过度激活： 联合模型组血浆PRA、Ang II、Ald水平显著升高，心肌组织RAS组分表达上调。
- 代谢紊乱： 联合模型组小鼠呈现严重的高胆固醇血症（TC、LDL-C显著升高）、高甘油三酯血症。
讨论：
- 模型优势：
- 病理机制更贴近临床： 同时模拟了心肌缺血损伤、持续心脏超负荷、脂质代谢紊乱（高胆固醇血症、动脉粥样硬化）三大核心因素，高度还原了人类缺血性心衰常合并代谢综合征的背景。
- 心衰表型加速且显著： HFD通过促进炎症、氧化应激、内皮功能障碍等途径，加剧了冠脉结扎后的心肌损伤、细胞凋亡和纤维化进程，显著缩短了慢性心衰模型形成时间，并诱导出更严重的收缩和舒张功能障碍、心室扩张和神经内分泌激活。
- 研究价值广泛： 该模型特别适用于研究代谢紊乱（如糖尿病、高脂血症）对缺血性心衰发生发展的影响及干预（如降脂药、胰岛素增敏剂、抗炎药等），也适用于评价针对心肌重构、纤维化、神经内分泌激活的新型治疗策略在复杂代谢背景下的效果。
- 局限性：
- 操作复杂性： 冠脉结扎术是精细的显微外科手术，技术要求高，存在一定的学习曲线和手术死亡率。
- ApoE-KO小鼠特性： ApoE缺失本身可能通过非脂质途径（如免疫调节）影响心血管系统。高脂饮食虽加速病变，但也引入了额外的变量（如肝脏脂肪变性、胰岛素抵抗）。
- 小鼠与人类差异： 小鼠心脏生理、心率、侧支循环等与人类存在差异，且无法完全模拟人类心衰的所有临床表现（如长期慢性病程的复杂性）。
- 成本： ApoE-KO小鼠和长期高脂饮食饲养成本高于普通品系小鼠和普通饲料。
- 模型应用要点：
- 严谨的手术操作和围术期管理是保证模型成功率和一致性的关键。
- HFD配方和喂养时长的选择需根据具体研究目的优化（如更侧重心衰还是动脉粥样硬化）。
- 设立合理的对照组（假手术+普通饮食、假手术+HFD、冠脉结扎+普通饮食）对于准确解读联合模型的效应至关重要。
- 多模态终点评价（超声、血流动力学、病理、分子生物学）能全面表征心衰表型。
结论：
冠脉永久结扎术联合高脂饮食诱导的ApoE-KO小鼠模型，成功整合了缺血性损伤、血流动力学超负荷和严重脂质代谢紊乱，能在相对短的时间内诱导出稳定且显著的慢性心力衰竭表型。该模型再现了人类缺血性心衰合并血脂异常的核心病理特征，包括严重的心室扩张、收缩/舒张功能障碍、心肌肥厚、广泛纤维化、神经内分泌系统激活以及生物标志物升高。尽管存在操作复杂性和种属差异等局限性，该模型为深入研究慢性心衰（尤其在代谢紊乱背景下）的复杂机制、病理进程以及开发新的治疗策略提供了一个高度相关且有力的临床前研究平台。其在评价靶向心肌重构、代谢调节及神经内分泌通路的干预措施方面具有独特优势。