冠脉短暂结扎诱导的心肌缺血/再灌损伤大鼠模型

发布时间：2025-07-01 08:01:52 阅读量：2 作者：生物检测中心

冠脉短暂结扎诱导的大鼠心肌缺血/再灌注损伤模型构建与应用

摘要： 心肌缺血/再灌注损伤（MIRI）是心血管疾病治疗中的关键病理过程。建立稳定可靠的动物模型是研究其机制与防治策略的基础。本文详细介绍冠脉左前降支（LAD）短暂结扎法诱导大鼠MIRI模型的原理、操作步骤、关键参数、模型评价指标及注意事项，为相关研究提供标准化参考。

一、 引言
心肌缺血后恢复血流本为救治目标，但再灌注过程本身可导致心肌细胞死亡、微血管功能障碍及炎症反应加剧，即MIRI。该过程涉及活性氧爆发、钙超载、线粒体功能障碍、炎症级联反应等多种机制。利用大鼠建立MIRI模型具有成本适中、遗传背景清晰、操作相对简便等优势，是研究该病理生理过程及药物干预效果的重要平台。

二、 模型原理
通过外科手术暂时性阻断供应左心室前壁及心尖部的主要血管——左冠状动脉前降支（LAD），造成目标心肌区域急性缺血。在设定的缺血时间后解除结扎，恢复冠脉血流，模拟临床溶栓、介入治疗或心脏手术中的血流再通，从而诱发典型的缺血/再灌注损伤。

三、 材料与方法

  1. 实验动物：

    • 品系：成年健康Sprague-Dawley (SD) 或 Wistar 大鼠。
    • 性别与体重：通常选用雄性，体重250-300g（或根据具体实验要求）。术前禁食6-8小时，自由饮水。
    • 伦理审查：所有操作必须严格遵守实验动物福利伦理规范，并获得相关委员会批准。

  2. 主要试剂与器械：

    • 麻醉剂： 推荐使用吸入性麻醉剂（如异氟烷）或腹腔注射麻醉组合（如戊巴比妥钠、氯胺酮/赛拉嗪）。
    • 手术器械： 动物呼吸机、体视显微镜、手术剪、显微剪、显微镊、持针器、缝合针线（如6-0或7-0聚丙烯线）、电热毯、小动物心电图（ECG）机、气管插管（如静脉留置导管改制）、微量注射器、棉签、碘伏消毒液、生理盐水、肝素钠溶液（抗凝）。
    • 术后药物： 抗生素（如青霉素）、镇痛药（如布托啡诺、美洛昔康）。

  3. 手术操作步骤：

    • 术前准备：
      • 大鼠称重，腹腔注射或吸入诱导麻醉。
      • 仰卧位固定于手术台，连接ECG电极监测心律。
      • 颈部备皮消毒，行气管切开术，插入气管插管，连接小动物呼吸机（参数：潮气量约3ml/100g体重，呼吸频率60-80次/分，吸呼比1:2）。
      • 胸部备皮消毒。
      • 皮下注射肝素钠（100-300 IU/kg）抗凝。
    • 开胸与心包暴露：
      • 沿胸骨左缘第3或第4肋间作一长约1.5-2cm的纵向切口。
      • 钝性分离肋间肌，小心撑开肋间隙暴露胸腔。
      • 用钝头镊子或棉签轻柔推开肺组织，暴露心脏及心包。
      • 沿左心耳方向小心剪开心包，充分暴露左心室表面及主动脉根部。
    • 左前降支（LAD）定位与结扎：
      • 在体视显微镜下观察，LAD通常起源于主动脉根部左冠窦，沿前室间沟下行至心尖。
      • 在左心耳下方、肺动脉圆锥旁，选择LAD近端1/3处（通常位于左心耳下缘与肺动脉圆锥之间）作为结扎点。
      • 使用弯头显微镊或特制的弯针（钝头），小心将6-0或7-0聚丙烯缝合线从LAD下方穿过心肌组织（避免直接刺穿血管）。关键点： 确保缝线环绕血管及少量心肌组织。
      • 将缝线两端穿过一段长度约2mm的软质硅胶管（或PE管）作为衬垫（用于减轻解除结扎时对血管的损伤）。
      • 轻轻提起缝线两端，将硅胶管轻轻压在LAD上，然后打一个松结（活结），暂时固定。此时LAD并未完全闭塞。
    • 诱导心肌缺血：
      • 收紧结扎线： 确认LAD被硅胶管压迫后，收紧缝线并打结固定，完全阻断LAD血流。记录缺血开始时间。
      • 确认缺血：
        • 肉眼观察： 结扎区域心肌（通常为左心室前壁及心尖）迅速（1-2分钟内）出现颜色变暗（苍白或发绀）、收缩减弱或膨出。
        • 心电图监测： 典型表现为ST段显著抬高（>0.1mV）或T波高耸。可能出现心律失常（如室性早搏）。
      • 维持设定的缺血时间（通常为30分钟或45分钟，根据研究目的设定）。
    • 诱导再灌注：
      • 到达预定缺血时间后，小心剪断结扎线结，迅速移除缝线和硅胶管，恢复LAD血流。记录再灌注开始时间。
      • 确认再灌注：
        • 肉眼观察： 缺血区域心肌颜色在1-2分钟内逐渐由暗变红，恢复收缩活动（可能仍较弱）。
        • 心电图监测： ST段逐渐回落（可能不完全回基线），可能出现再灌注性心律失常（如室速、室颤）。
    • 关胸与术后护理：
      • 确认心脏跳动有力后，仔细检查胸腔内无活动性出血。
      • 用5-0或6-0缝线逐层缝合肋间肌和皮肤。
      • 轻柔挤压胸腔排出残余气体，恢复大鼠自主呼吸。
      • 待大鼠恢复自主呼吸且呼吸平稳后，小心拔除气管插管。
      • 皮下注射生理盐水（1-2ml/100g）补充体液，注射抗生素预防感染，注射长效镇痛药缓解疼痛。
      • 将大鼠置于温暖（37°C）的恢复笼中，密切监护至完全清醒。术后24-48小时继续提供镇痛和保暖。

  4. 假手术组：

    • 除不进行LAD的结扎和松开步骤外，其余所有操作（麻醉、开胸、心包切开、穿线但不打结、关胸等）均与模型组相同。用于排除手术操作本身对结果的影响。
 

四、 模型评价指标

  1. 在体指标：

    • 血流动力学： 监测再灌注期间心率、血压的变化（如平均动脉压下降提示心功能受损）。
    • 心律失常评分： 记录再灌注后特定时间内（如前30分钟）心律失常的发生类型、频率和持续时间，进行标准化评分（如Lambeth Conventions）。
    • 存活率： 记录手术中和术后24小时内的动物死亡率。

  2. 离体指标（通常在再灌注结束后即刻或预定时间点处死取材）：

    • 梗死面积测定（金标准）：
      • Evans Blue/TTC双重染色法：
        1. 再灌注结束后，重新结扎LAD（或经主动脉根部注入）。
        2. 经主动脉根部或颈静脉注入1%-2%的Evans Blue溶液，使非缺血区域染为蓝色，缺血危险区（AAR）不着色。
        3. 迅速取出心脏，清洗，于-20°C冰箱速冻10-20分钟。
        4. 将心脏横切成厚度均等的薄片（约1-2mm）。
        5. 将切片置于1%-2%的氯化三苯基四氮唑（TTC） 磷酸盐缓冲液（37°C）中避光孵育15-20分钟。存活心肌因含活性脱氢酶将TTC还原为红色甲臜(formazan)，梗死心肌（Infarct）呈苍白色。
        6. 数码相机拍照记录。
        7. 使用图像分析软件分别计算：AAR占左心室面积（LV）的百分比（AAR/LV%），梗死面积占危险区面积的百分比（IS/AAR%）。IS/AAR%是评价心肌损伤程度的核心指标。
    • 血清心肌酶学检测： 再灌注后不同时间点采集血液，离心取血清，检测肌酸激酶同工酶（CK-MB）、乳酸脱氢酶（LDH）、心肌肌钙蛋白I（cTnI）或T（cTnT）水平，反映心肌细胞坏死程度。
    • 组织病理学检查：
      • 光镜（HE染色）： 观察心肌组织形态结构变化：缺血区心肌细胞肿胀、横纹模糊或消失、嗜酸性变、核固缩碎裂、炎性细胞浸润、间质水肿、出血等。评估心肌损伤评分。
      • 电镜： 观察心肌细胞超微结构损伤：线粒体肿胀、嵴断裂空泡化、肌原纤维断裂溶解、核染色质边集等。
    • 分子生物学检测： 检测心肌组织中与氧化应激（MDA、SOD、GSH-Px）、炎症（TNF-α, IL-1β, IL-6, MPO）、凋亡（Bax, Bcl-2, Caspase-3活性）、自噬（LC3-II/I, Beclin-1, p62）、信号通路（如PI3K/Akt, MAPK, AMPK, NLRP3炎性体）等相关的蛋白或基因表达水平。
 

五、 关键操作要点与注意事项

  1. 麻醉管理： 深度要适中且稳定。过浅易诱发室颤；过深抑制呼吸循环。吸入麻醉易于调控深度。
  2. 呼吸管理： 气管插管和机械通气是保证通气和氧合、提高存活率的关键。注意潮气量和频率设置，避免气压伤。
  3. LAD定位： 准确识别LAD是成功建模的核心。近端结扎（左心耳根部下方）可产生较大范围的缺血危险区。个体间LAD走行存在变异，需仔细辨别。
  4. 结扎技巧： 缝线穿过心肌组织应适度（避免过深伤及右心室），使用硅胶管衬垫可显著减少再灌注时血管损伤和出血风险。打结力度适中，确保完全阻断血流但不过度牵拉心脏。
  5. 时间控制： 精确控制缺血时间和再灌注时间是模型一致性的保障。使用计时器。
  6. 温度维持： 术中及术后维持动物体温（37±0.5°C）至关重要，低体温可加重心律失常和心功能抑制。使用电热毯和温毯。
  7. 无菌操作： 严格无菌操作，术后预防性使用抗生素，降低感染风险。
  8. 镇痛管理： 充分的术后镇痛是动物福利要求，也有助于动物平稳恢复。
  9. 熟练操作： 该模型手术操作要求较高，需经过专业培训和反复练习，方能提高成功率，降低死亡率。初学者建议在有经验者指导下进行。
  10. 心律失常处理： 再灌注早期室颤发生率较高。可备好除颤设备（小动物除颤器）或抗心律失常药物（如利多卡因）。轻微室性心律失常常可自行恢复。
  11. 伦理与替代： 严格遵守3R原则（替代、减少、优化），使用动物数量应经统计学估算确定最小值，积极寻求体外模型等替代方法。
 

六、 模型应用
该模型广泛应用于：

  • 机制研究： 深入探索MIRI的发生发展机制（如氧化应激、钙超载、炎症反应、细胞死亡途径等）。
  • 药物评价： 筛选和评价具有心肌保护作用的新药或干预措施（如缺血预适应、后适应、远隔缺血预适应等）。
  • 治疗策略优化： 研究不同再灌注策略（如控制性再灌注）的保护效果。
  • 生物材料/器械评估： 评估用于心肌修复的生物材料或器械在缺血再灌注环境下的性能。
 

七、 讨论
冠脉短暂结扎法是目前应用最广泛、技术最成熟的大鼠MIRI模型之一，能较好地模拟临床心肌梗死再灌注治疗的病理过程，具有缺血/再灌注时间可控、损伤指标（特别是梗死面积）可量化、重复性相对较好等优点。然而，该模型也存在一定局限性：手术创伤较大、操作技术要求高、存在一定死亡率（尤其在再灌注早期）；大鼠心脏解剖、侧支循环、对缺血耐受性等方面与人类存在差异。因此，在解释实验结果和向临床转化时需谨慎。

八、 结论
通过标准化操作流程（包括精准的LAD结扎与松解、严格的缺血/再灌注时间控制、全面的术中监护与术后护理），冠脉短暂结扎法能够成功建立稳定可靠的大鼠心肌缺血/再灌注损伤模型。结合多层次的评价指标（如梗死面积、血清标志物、组织病理学、分子生物学），该模型为深入研究MIRI的病理机制及开发有效的防治策略提供了强有力的实验平台。研究者应时刻关注动物福利，持续优化模型，以获取更可靠、更具转化价值的研究数据。

请注意： 本文旨在提供标准化的实验方法学描述。实际研究设计（如具体的缺血/再灌注时间、动物品系选择、样本量、检测指标组合等）应根据具体科学问题和实验条件进行详细规划和论证。