TAA诱导的小鼠或大鼠肝纤维化模型

发布时间：2025-06-30 18:11:38 阅读量：2 作者：生物检测中心

TAA诱导的小鼠或大鼠肝纤维化模型：原理与应用

硫代乙酰胺 (Thioacetamide, TAA) 是一种被广泛用于建立实验性肝纤维化和肝硬化动物模型的经典肝毒性物质。其诱导的病理过程在多个方面与人类肝纤维化进展相似，使其成为研究肝纤维化发病机制、潜在治疗靶点及药物干预效果的重要工具模型。

一、 作用机制

TAA主要通过肝脏代谢激活发挥其肝毒性作用：

  1. 代谢活化： TAA经肝细胞微粒体细胞色素P450酶系统（主要是CYP2E1）代谢为活性中间产物 硫代乙酰胺-S-氧化物 (TASO) 和 硫代乙酰胺-S, S-二氧化物 (TASO₂)。
  2. 肝损伤：
    • 自由基损伤： TASO₂ 等活性代谢物可诱导产生活性氧 (ROS)，导致脂质过氧化、蛋白质氧化和DNA损伤。
    • 共价结合： 活性代谢物可与肝细胞内重要的生物大分子（如蛋白质、核酸）发生共价结合，干扰其正常功能。
    • 线粒体损伤： 破坏线粒体结构和功能，影响能量代谢，加剧氧化应激。
    • 细胞内钙稳态失衡： 导致钙依赖性酶的异常激活。
  3. 炎症反应： 持续的肝细胞损伤释放损伤相关分子模式 (DAMPs)，激活枯否细胞（肝巨噬细胞），释放大量促炎细胞因子（如TNF-α, IL-1β, IL-6）和趋化因子，募集中性粒细胞、单核细胞等炎症细胞浸润肝脏，形成炎症灶。
  4. 肝星状细胞活化与纤维化形成： 持续的肝损伤和炎症是关键的驱动因素。它们刺激静息状态的肝星状细胞 (HSC) 转化为增殖、收缩、纤维生成的肌成纤维细胞样细胞。活化的HSC大量合成和分泌细胞外基质 (ECM) 成分，主要是胶原蛋白（I型、III型为主），同时ECM降解（主要由基质金属蛋白酶及其抑制物调控）失衡，导致ECM在肝内异常沉积，逐渐形成纤维间隔，最终导致肝纤维化乃至肝硬化（长期给药时）。
 

二、 动物选择与模型建立

  1. 常用动物：
    • 大鼠： 最常用，尤其是Sprague-Dawley (SD) 和 Wistar 大鼠。体型较大，操作相对方便，血量充足便于多次采样，对TAA诱导的肝纤维化反应稳定可靠。通常选用雄性，以避免雌性激素对肝脏保护作用的潜在影响。
    • 小鼠： 常用于需要基因修饰（如转基因、基因敲除）的研究。C57BL/6是常用品系。成本相对较低，繁殖快。但体型小，采血量有限，操作需更精细。
  2. 给药途径：
    • 腹腔注射 (Intraperitoneal injection, IP)： 最常用且推荐的方法。优点是剂量可控性好，吸收相对稳定快速，重复给药操作可行性强。需要注意无菌操作和注射技巧，避免损伤内脏。
    • 饮用水 (Drinking water)： 操作简便，动物应激小。缺点是剂量控制相对不精确（个体饮水量差异），模型诱导时间较长（通常需12周以上才能形成显著纤维化），且TAA水溶液不稳定，需频繁更换。
    • 灌胃 (Oral gavage)： 可精确控制单次剂量，但操作不当易造成食管或气道损伤，反复操作带来的应激较大。
  3. 给药剂量与方案（需根据动物品系、体重、具体研究目标优化）：
    • 剂量范围：
      • 大鼠：常用剂量为 100 - 250 mg/kg 体重。
      • 小鼠：常用剂量为 100 - 300 mg/kg 体重。
    • 给药频率： 通常为 每周2-3次。
    • 建模周期：
      • 肝纤维化： 通常需要 6-12周 的连续给药。
      • 肝硬化： 通常需要 12周以上甚至长达6个月 的连续给药。
    • 剂量调整： 在建模过程中，需要密切监测动物状态（体重、活动度、毛发、死亡率）。若毒性过大（体重急剧下降、活动减少、高死亡率），应考虑适当降低剂量（如从200mg/kg降至150mg/kg）或延长给药间隔。反之，若进展缓慢，可谨慎提高剂量或频率。
    • 溶剂： TAA通常用 无菌生理盐水 (0.9% NaCl) 溶解配制成所需浓度。使用前新鲜配制或短期冷藏保存。
  4. 对照组设置： 必须设置 生理盐水对照组（与TAA组同体积溶剂腹腔注射或灌胃），以排除溶剂和操作本身的影响。
 

三、 模型评估与验证

需采用多指标综合评估模型是否成功建立及纤维化程度：

  1. 一般状态监测： 定期记录体重变化、精神状态、活动度、毛发状态、死亡率。
  2. 血清生化指标： 抽取血液分离血清检测。
    • 肝损伤标志物： 丙氨酸氨基转移酶 (ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶 (AST) 显著升高，反映肝细胞损伤程度。
    • 胆汁淤积标志物： 碱性磷酸酶 (ALP)、γ-谷氨酰转移酶 (GGT)、总胆红素 (TBIL) 可能在后期或严重胆汁淤积时升高。
    • 肝功能指标： 白蛋白 (ALB) 可能逐渐降低，凝血酶原时间 (PT) 可能延长，反映肝功能储备下降。
  3. 肝脏组织病理学检查（金标准）：
    • 取样： 实验结束时处死动物，取肝脏组织固定（常用10%中性福尔马林）。
    • 常规染色 (H&E)： 观察肝细胞坏死、气球样变、炎症细胞浸润、脂肪变性、胆管增生等损伤特征。
    • 胶原特异性染色：
      • 天狼星红染色 (Sirius Red Staining)： 最常用。染色胶原纤维呈鲜红色或橙红色（偏振光下I型胶原呈黄/橙红，III型胶原呈绿）。可定量分析（图像分析胶原面积百分比）评估纤维化程度。
      • 马松三色染色 (Masson’s Trichrome Staining)： 将胶原染成蓝色或绿色，清晰显示纤维间隔和汇管区纤维化。
    • 纤维化半定量评分系统： 常用如 Ishak、METAVIR、Knodell 等系统，根据纤维间隔的形态、宽度、数量及其对肝小叶结构的破坏程度进行评分分级（如 F0：无纤维化；F1：汇管区纤维化扩大；F2：汇管区纤维间隔形成；F3：桥接纤维化；F4：肝硬化）。
  4. 肝组织羟脯氨酸含量测定： 羟脯氨酸是胶原蛋白的特征性氨基酸，其含量可定量反映肝组织总胶原沉积量，是评价纤维化程度的客观定量指标。
  5. 活化肝星状细胞标志物检测：
    • 免疫组织化学/免疫荧光染色： 检测α-平滑肌肌动蛋白 (α-SMA) 的表达（活化HSC的标志物），观察其在肝组织中的分布和数量变化。
    • 蛋白质印迹 (Western Blot) / 实时荧光定量 PCR (qRT-PCR)： 检测肝组织中α-SMA、胶原I、胶原III、TGF-β1（关键的促纤维化因子）等纤维化相关基因或蛋白的表达水平。
  6. 影像学评估（非侵入性或离体）： 如超声弹性成像、磁共振弹性成像 (MRE) 可用于活体评估肝脏硬度（间接反映纤维化程度），微型CT可用于评估肝硬化结节形态（离体或活体）。
 

四、 模型特点与评价

  • 优点：
    1. 病理相似性高： TAA诱导的肝纤维化/肝硬化的病理特征（肝细胞损伤、炎症浸润、进行性的纤维间隔形成、假小叶结构、门静脉高压等）与人类慢性肝病（如病毒性肝炎、酒精性肝病）进展过程高度相似。
    2. 模型稳定可靠： 给药方案可控性强（尤其是腹腔注射），模型成功率和重复性好。纤维化程度与给药剂量和持续时间呈剂量依赖性。
    3. 应用广泛： 是目前研究肝纤维化发病机制、寻找抗纤维化靶点、评估潜在治疗药物（小分子化合物、生物制剂、干细胞疗法、基因治疗等）疗效及作用机制的金标准模型之一。
    4. 可进展至肝硬化： 长期给药可诱导形成明确的肝硬化模型，用于研究肝硬化及其并发症（如门脉高压、肝性脑病模型的基础）。
  • 缺点与局限性：
    1. 毒性较大： 高剂量或个体差异可能导致动物急性肝衰竭甚至死亡，需精细调整剂量和密切监护。
    2. 建模周期较长： 诱导显著的纤维化或肝硬化需要数周至数月的持续给药，时间和资源成本较高。
    3. 动物应激： 反复腹腔注射或灌胃操作会给动物带来一定的应激。
    4. 非特异性损伤： TAA主要通过直接肝毒性诱发损伤和纤维化，其起始机制与人类常见的病毒、酒精、代谢等因素诱发的肝纤维化并不完全相同。
    5. 个体差异： 即使严格控制条件，动物对TAA的反应仍存在一定个体差异。
    6. 自愈倾向（大鼠）： 停止TAA给药后，大鼠肝纤维化可能表现出一定程度的自发逆转倾向（尤其是在早期），这在评估长期干预效果时需要考虑并在实验设计时设置停药后观察点。
 

五、 注意事项

  1. 动物福利： 严格遵守实验动物伦理规范，尽量减少动物痛苦。出现严重不良反应（如体重骤降>20%、濒死状态）应及时安乐死。提供充足的食物和水。
  2. 剂量优化是关键： 首次使用或更换动物品系时，强烈建议进行剂量探索实验（Pilot study），从小剂量开始，根据动物状态和初步病理结果逐步调整至合适的剂量和方案。
  3. 严格无菌操作： 腹腔注射等操作需在无菌环境下进行，防止感染。
  4. 标准化操作： 固定给药人员、时间、操作流程，减少人为误差。
  5. 充分设置对照组： 不仅是溶剂对照，必要时应设置正常饲养组作为基础对照。
  6. 多指标综合评估： 不应仅依赖单一指标（如血清ALT或天狼星红染色）判断模型成功与否和纤维化程度，需结合生化、组织学、分子生物学等多方面证据。
 

总结：

TAA诱导的小鼠或大鼠肝纤维化模型是一种成熟、可靠且病理特征与人类疾病高度相似的实验工具。通过腹腔注射给药（推荐）并优化剂量和周期，可以在可控的时间内诱导出从轻度纤维化到肝硬化的不同程度病变。尽管存在一定的局限性（如毒性、周期长），其良好的可重复性和病理相似性使其在肝纤维化基础研究和抗纤维化药物开发中占据不可替代的地位。成功的模型构建依赖于精细的剂量控制、严格的实验操作规范以及多维度、系统性的模型评估。