CCl₄诱导的小鼠或大鼠肝纤维化模型

CCl₄诱导啮齿类肝纤维化模型标准化方案

一、引言
肝纤维化是慢性肝损伤修复过程中细胞外基质过度沉积的病理状态，是多种慢性肝病进展为肝硬化的关键环节。四氯化碳（CCl₄）诱导的啮齿类（小鼠或大鼠）肝纤维化模型因其病理特征与人肝纤维化高度相似、操作相对简便、重现性好，成为肝纤维化机制研究及药物临床前评价的核心工具。

二、模型机制
CCl₄经肝脏细胞色素P450酶（主要为CYP2E1）代谢为高反应活性自由基（·CCl₃ 和 Cl·）。这些自由基：

1. 脂质过氧化： 攻击肝细胞膜不饱和脂肪酸，破坏膜结构与功能。
2. 共价结合： 与细胞内蛋白质、核酸等大分子共价结合，干扰其功能。
3. 钙稳态失衡： 导致细胞内钙超载，激活降解酶。
4. 线粒体损伤： 损害能量代谢，诱发凋亡/坏死。
   持续的肝细胞损伤激活炎症反应及肝星状细胞（HSCs），使其转化为促纤维化的肌成纤维细胞，大量合成Ⅰ、Ⅲ型胶原等细胞外基质成分，最终导致纤维间隔形成与肝结构重塑。

三、材料与方法

1. 实验动物：

   • 物种选择： 常用雄性C57BL/6小鼠（8-10周龄，体重18-22g）或雄性SD/Wistar大鼠（6-8周龄，体重180-220g）。雄性动物因激素水平差异，通常对CCl₄更敏感。
   • 饲养条件： SPF级动物房，恒温（22±2℃）、恒湿（55±10%）、12小时光暗循环，自由饮水、摄食标准饲料。适应性饲养至少1周。

2. 主要试剂与仪器：

   • 试剂： 四氯化碳（CCl₄，分析纯）、橄榄油（或玉米油，作为溶剂）、生理盐水。
   • 分析试剂： 苏木精-伊红（H&E）染色套件、天狼猩红（Sirius Red）染色套件、Masson三色染色套件、羟脯氨酸（Hyp）检测试剂盒、血清生化指标（ALT，AST）检测试剂盒、相关RNA/DNA提取、qPCR、Western Blot、ELISA及免疫组化试剂（如α-SMA、Collagen I抗体）。
   • 仪器： 精密电子天平、微量注射器（小鼠）、灌胃针（大鼠）、手术器械、离心机、分光光度计/酶标仪、显微镜（含成像系统）、冰冻/石蜡切片机、PCR仪、电泳及转膜系统等。

3. 模型建立方法：

   • 给药途径：
     • 腹腔注射（i.p.）： 最常用。CCl₄用橄榄油稀释（重要： 操作需在通风橱中进行）。
     • 灌胃（i.g.）： 需注意操作准确性，避免食管损伤。
     • 皮下注射（s.c.）： 相对应用较少。
   • 给药方案（示例，需优化）：
     • 小鼠模型（腹腔注射）：

       给药浓度	给药体积	给药频率	周期	预期结果
       0.5-1.0%（v/v）	5-10 μL/g bw	每周2次	4-8周	显著肝纤维化
       1.5-2.0%（v/v）	2-5 μL/g bw	每周2次	2-4周	快速诱导

     • 大鼠模型（腹腔注射）：

       给药浓度	给药体积	给药频率	周期	预期结果
       20-50%（v/v）	1-3 mL/kg bw	每周1-2次	6-8周	稳定肝纤维化/早期肝硬化
       40-60%（v/v）	2-3 mL/kg bw	每周2次	4-6周	快速诱导

     • 对照设置： 溶剂对照组（橄榄油），给予等体积溶剂，频率、周期同处理组。
     • 优化要点： 剂量、频率、周期需根据动物品系、实验目的（轻度/重度纤维化）、动物死亡率进行调整。初期应进行剂量摸索实验。

4. 观察与样本采集：

   • 体重监测： 定期称重，评估毒性反应。
   • 动物状态： 观察活动、毛色、精神状态、死亡情况。
   • 样本采集（终点）：
     • 血液： 麻醉后心脏采血或眼眶后静脉丛采血，分离血清检测ALT、AST等肝损伤标志物及生化指标。
     • 肝脏： 快速完整取出肝脏，称重（计算肝指数=肝重/体重×100%）。取材：
       • 固定：部分肝叶（左叶/中叶）置于4%多聚甲醛（24-48小时）用于病理。
       • 速冻：部分肝叶（右叶）液氮速冻后转-80℃冷藏，用于分子生物学检测（RNA/DNA/蛋白）。
       • 消化/匀浆：部分组织用于羟脯氨酸含量测定（胶原定量）。

5. 纤维化评价方法：

   • 血清生化： ALT、AST水平反映肝细胞损伤程度，是模型成功的关键初筛指标。
   • 组织病理学（金标准）：
     • H&E染色： 观察肝组织结构破坏、坏死灶、炎症细胞浸润、脂肪变性等。
     • 胶原特异性染色：
       • 天狼猩红染色： 特异性显示Ⅰ、Ⅲ型胶原（红色），偏振光下显双折光性，便于定量分析。
       • Masson三色染色： 胶原呈蓝色，直观显示纤维间隔与汇管区纤维化程度。
     • 半定量评分： 常用Knodell、Ishak、Metavir或Scheuer评分系统评估纤维化分期（F0-F4）及炎症坏死程度（G）。
     • 定量分析： 利用图像分析软件测量天狼猩红或Masson阳性染色区域占肝脏实质区域的百分比。
   • 羟脯氨酸含量测定： 胶原蛋白特征性氨基酸含量，反映肝组织总胶原含量。
   • 分子生物学检测：
     • mRNA水平： qPCR检测Col1a1、Col3a1、α-SMA、TGF-β1、TIMP-1、MMP-2/9等纤维化相关基因表达。
     • 蛋白水平：
       • Western Blot： 检测α-SMA、Collagen I、TGF-β1等蛋白表达。
       • 免疫组织化学/免疫荧光： 在组织原位定位观察α-SMA阳性细胞（活化的HSCs）、Collagen I沉积等。

四、典型结果

1. 宏观： 肝脏体积增大、边缘变钝、表面粗糙、呈颗粒状或结节状（后期），颜色灰白或黄白相间。
2. 血清生化： CCl₄组血清ALT、AST水平显著高于溶剂对照组。
3. **组织病理：
   • H&E： 肝细胞弥漫性气球样变、脂肪变性、点状/灶状/桥接坏死；汇管区及坏死灶周围大量炎细胞（淋巴细胞、中性粒细胞、巨噬细胞）浸润。
   • 胶原染色： 汇管区显著扩大，纤维组织增生并延伸包绕肝小叶，形成纤细或粗大的纤维间隔（桥接纤维化），甚至形成假小叶（肝硬化）。阳性染色面积显著增加。
4. 羟脯氨酸： 肝组织中Hyp含量显著升高。
5. 分子表达： α-SMA、Col1a1、TGF-β1等促纤维化因子mRNA和蛋白表达显著上调。

五、模型优缺点与注意事项

• 优点：
  1. 病理特征（肝细胞损伤、炎症、HSC活化、胶原沉积、假小叶形成）高度模拟人类肝纤维化/肝硬化进程。
  2. 技术成熟、操作相对简便、成本较低。
  3. 模型稳定性及重复性较好。
  4. 可通过调整给药方案控制纤维化程度（轻-中-重）。
• 缺点与注意事项：
  1. 急性毒性： CCl₄本身毒性强，动物耐受性差异可能导致高死亡率。需严格优化剂量、频率，密切观察动物状态。
  2. 肝外毒性： 对肾、肺有一定毒性。
  3. 个体差异： 动物对CCl₄敏感性存在个体差异。
  4. 溶剂影响： 橄榄油作为溶剂干扰脂质代谢研究。
  5. 操作安全： CCl₄易挥发、有毒（肝、肾、神经毒性）、致癌，配制、注射全程须在高效通风橱中进行，操作者佩戴双层手套、口罩、护目镜及防护服，废弃物按有害化学品处理。
  6. 替代模型： 需考虑其他模型优劣（如胆管结扎术BDL、硫代乙酰胺TAA、酒精加高脂饮食等）以匹配特定研究目的。

六、替代方案与改良

• 溶剂替代： 对代谢研究要求高时可选用矿物油（较少干扰脂代谢）。
• 复合模型： CCl₄联合酒精喂养或高脂饮食（NASH相关纤维化模型）。
• 基因工程小鼠： 特定基因敲除/过表达小鼠结合CCl₄诱导，研究特定基因在纤维化中的作用。

七、伦理声明
所有动物实验操作必须严格遵循实验动物福利伦理原则（如国际公认的“3R”原则），并获得所在机构动物实验伦理委员会的审查批准。实验过程中应最大程度减少动物痛苦，提供适宜的环境和护理，实施人道终点，必要时给予镇痛处理。

结论
CCl₄诱导的啮齿类肝纤维化模型是研究肝纤维化发病机制、病理生理过程及筛选评价抗纤维化药物不可或缺的工具。其成功建立依赖于严谨的实验设计、精确的剂量控制、规范的操作流程及多维度的评价体系。研究者应充分认识其优缺点，严格遵守伦理规范和安全操作规程，以确保实验结果的科学性和可靠性。

重要提示：

• 剂量与周期是核心变量，需预实验摸索。
• 通风橱操作与个人防护至关重要！
• 严格遵守动物伦理规范。

该方案提供了建立和使用CCl₄肝纤维化模型的全面框架，研究者可根据具体科研目标和实验室条件进行调整优化。