APAP诱发的小鼠急性肝损伤模型

发布时间:2025-06-30 17:57:07 阅读量:2 作者:生物检测中心

APAP诱发的小鼠急性肝损伤模型:机制、建立与评价

对乙酰氨基酚(APAP)所致药物性肝损伤是临床急性肝衰竭的主要原因之一,也是药物安全性评价的重点关注对象。APAP诱导的小鼠急性肝损伤模型因其损伤机制与人类高度相似、重复性好、操作相对简便,成为研究药物性肝损伤机制及筛选保肝药物的重要标准化工具


一、 模型建立原理与机制

  1. 治疗剂量与代谢: 治疗剂量下,APAP主要在肝脏经葡萄糖醛酸化和硫酸化途径代谢为无毒产物排出。少量经细胞色素P450酶(主要是CYP2E1、CYP1A2、CYP3A4)代谢为高活性的亲电子中间体N-乙酰对苯醌亚胺(NAPQI)
  2. 毒性剂量与损伤启动: 过量APAP摄入超出肝脏结合代谢能力,导致NAPQI大量生成。NAPQI可快速与谷胱甘肽(GSH)结合而解毒。当肝细胞内GSH储备耗竭后,过剩的NAPQI与肝细胞内关键的蛋白质半胱氨酸残基共价结合,导致蛋白质功能丧失、线粒体功能障碍(尤其抑制呼吸链复合物I和II),产生活性氧(ROS)。
  3. 氧化应激与线粒体损伤: 线粒体功能障碍和ROS爆发导致严重的氧化应激,进一步损伤线粒体膜通透性转换孔(mPTP)开放,线粒体膜电位崩溃,能量耗竭。
  4. 坏死性细胞死亡与炎症放大: 持续的氧化应激和能量耗竭最终触发肝细胞坏死(主要为凝固性坏死)。坏死的肝细胞释放损伤相关分子模式(DAMPs),激活肝内先天免疫细胞(如Kupffer细胞),释放大量促炎细胞因子(如TNF-α, IL-1β, IL-6)和趋化因子,募集循环中的中性粒细胞和单核细胞,放大炎症反应,加剧肝损伤。
  5. 损伤区域: 损伤始于肝小叶中心静脉(Zone 3)周围的肝细胞,该区域CYP450酶表达最高,对APAP代谢最活跃。
 

二、 模型建立方法

  1. 实验动物选择:

    • 品系: 常用品系包括C57BL/6、BALB/c、ICR(CD-1)小鼠。C57BL/6最为常用,因其对APAP敏感性适中且研究背景数据丰富。
    • 性别: 通常使用雄性小鼠。研究表明雄性小鼠CYP2E1活性高于雌性,对APAP更敏感,损伤程度更重、更一致。若研究性别差异,则需同时使用雄性和雌性小鼠。
    • 体重/周龄: 通常选用8-12周龄、体重20-25g的健康成年小鼠。动物需在标准SPF级动物房适应性饲养至少一周。
  2. APAP溶液配制:

    • 溶剂: 常用溶剂为预热(约50-60°C)的生理盐水或磷酸盐缓冲液(PBS)。APAP在冷水中溶解度较低,预热可增加溶解度。溶液需在临用前配制,并冷却至室温或体温。
    • 浓度: 根据目标剂量和给药体积确定。常用浓度范围在15-35 mg/mL(溶解于预热生理盐水/PBS中)。
    • 给药剂量:
      • 关键参数: 剂量是模型成功与否的关键。过低可能损伤轻微或不显著,过高则可能迅速导致高死亡率。
      • 常用范围: 腹腔注射(i.p.)或灌胃(p.o.)给药。腹腔注射更常用,吸收更快更可靠。
        • 腹腔注射(i.p.): 常用剂量范围250-350 mg/kg300 mg/kg 是一个常用起始点,可产生显著的肝损伤(通常在给药后6-24小时达峰)而死亡率相对可控。对于C57BL/6雄性小鼠,350 mg/kg 常被用于产生更严重的损伤。
        • 灌胃(p.o.): 剂量通常需略高于i.p.剂量,常用范围400-600 mg/kg,因为首过效应和吸收效率差异。
    • 给药体积: 通常控制在5-10 mL/kg体重(如0.1mL/20g小鼠)。体积过大可能造成额外应激。
  3. 禁食处理(推荐):

    • 目的: 禁食状态下肝内GSH水平降低,可增强小鼠对APAP肝毒性的敏感性(更接近人类空腹服药情况),使模型损伤程度更显著、更一致。
    • 方法: 在APAP给药前禁食12-16小时(通常在晚上开始禁食,次日早晨给药),自由饮水。
  4. 给药:

    • 严格按照预定剂量和体积给药(腹腔注射或灌胃)。
    • 对照组给予等体积的溶剂(预热生理盐水或PBS)。
    • 记录给药准确时间和动物状态。
  5. 模型观察与取材:

    • 观察时间点: 损伤通常在给药后2-6小时开始出现,12-24小时达到高峰,之后可能进入修复期或发展为更严重的肝衰竭。关键评价点常设在给药后6、12、24、48小时
    • 动物状态观察: 密切观察小鼠活动、精神状态、被毛、呼吸、姿势等。严重损伤小鼠可出现活动减少、嗜睡、弓背、呼吸急促、被毛逆立等表现。
    • 样本采集:
      • 血液: 在预定时间点(如6、12、24、48h)麻醉动物(如异氟烷或巴比妥类药物),经心脏穿刺或眼眶后静脉丛采集血液。离心分离血清/血浆,于-80°C保存,用于生化指标检测。
      • 肝脏:
        • 大体观察: 摘取肝脏,观察颜色(是否淤血、苍白)、质地(是否变脆)、有无坏死斑点(通常中心区暗红/苍白)。
        • 称重: 计算肝指数(肝重/体重×100%),反映肝脏肿大程度(损伤初期可能肿大)。
        • 组织分装:
          • 石蜡/冰冻切片: 取代表性肝叶(常取左叶同一位置)切取约0.5 cm³组织块,立即投入4%多聚甲醛(PFA)固定液中(室温固定24-48h后转入70%乙醇)用于石蜡包埋和常规H&E染色;或包埋于OCT中速冻于液氮/干冰,用于冰冻切片(如油红O染色、免疫荧光)。
          • 生化/分子生物学分析: 切取另一部分肝组织(约100mg),迅速置于液氮中速冻,后转移至-80°C保存,用于后续匀浆提取蛋白、RNA、DNA或测定GSH、MDA等生化指标。
          • Western Blot/ELISA蛋白检测: 取适量组织液氮速冻后-80°C保存。
        • 新鲜组织消化: 用于分离肝实质细胞或非实质细胞(如Kupffer细胞、星状细胞、肝窦内皮细胞)进行原代培养或流式分析。
 

三、 模型评价指标

  1. 血清生化指标(肝损伤标志物):

    • 丙氨酸氨基转移酶(ALT): 肝细胞损伤最敏感、最常用的指标。APAP肝损伤时血清ALT活性显著升高(可达基线值数十倍至数百倍)。
    • 天冬氨酸氨基转移酶(AST): 肝细胞损伤时也升高,但特异性稍低于ALT(心肌、骨骼肌损伤也可升高)。
    • 乳酸脱氢酶(LDH): 广泛存在于多种细胞中,其升高指示组织坏死程度。
    • 总胆红素(TBIL): 反映肝脏结合排泄能力,严重肝损伤时可升高。
  2. 肝脏组织病理学评价(金标准):

    • 苏木精-伊红(H&E)染色:
      • 坏死区域: 观察肝小叶结构,重点评估中心静脉周围(Zone 3)肝细胞的坏死程度、范围和分布。坏死肝细胞表现为体积缩小、胞浆嗜酸性增强(粉染)、核固缩、碎裂或溶解消失。严重时可见大片融合性坏死。
      • 炎症细胞浸润: 观察坏死灶及汇管区中性粒细胞、单核/巨噬细胞等炎症细胞的浸润情况。
      • 充血/出血: 中心静脉及肝窦扩张充血,有时可见出血。
      • 空泡变性/气球样变: 损伤早期可能观察到。
    • 组织学评分系统:
      • 常用半定量评分方法(如0-4分)评估肝小叶坏死面积百分比:
        • 0分:无坏死
        • 1分:<25% 小叶坏死
        • 2分:25%-50% 小叶坏死
        • 3分:50%-75% 小叶坏死
        • 4分:>75% 小叶坏死
      • 同时评估炎症程度等。
  3. 氧化应激指标测定:

    • 肝组织还原型谷胱甘肽(GSH)含量: APAP肝损伤早期核心事件。肝组织GSH水平在给药后1-2小时即显著耗竭。
    • 丙二醛(MDA)含量: 反映脂质过氧化程度(氧化应激产物)。
    • 超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)活性: 反映机体抗氧化能力,损伤时活性可能下降。
    • 活性氧(ROS)水平: 可通过荧光探针(如DCFH-DA)在组织匀浆、原代细胞或冰冻切片中检测。
  4. 炎症因子水平:

    • 血清/肝组织匀浆: 检测关键促炎因子如TNF-α, IL-1β, IL-6的水平(常用ELISA或Luminex多因子检测)。
    • 免疫组织化学(IHC)或免疫荧光(IF): 定位炎症因子在肝组织中的表达及细胞来源。
  5. 肝细胞死亡检测:

    • TUNEL染色: 检测DNA断裂,指示细胞凋亡/坏死。APAP诱导的主要是坏死,后期也可能有继发性凋亡。TUNEL阳性细胞应与坏死区域一致(Zone 3)。
    • Caspase活性检测(如Caspase-3): 凋亡相关,APAP模型中激活程度通常较低。
  6. 肝再生/修复相关指标:

    • 增殖细胞核抗原(PCNA)染色或Ki-67染色: 检测损伤后残存肝细胞的增殖情况(通常在损伤后24-48小时开始出现)。
    • 肝再生相关因子表达: 如肝细胞生长因子(HGF)、白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子受体(TNFR)等(可通过qPCR、Western Blot检测)。
 

四、 模型优缺点与注意事项

  1. 优点:

    • 损伤机制清晰,与人类APAP肝毒性高度相似。
    • 方法相对简便易行,重复性好,成本可控。
    • 损伤程度可通过剂量和时间点进行精确调控。
    • 是研究药物性肝损伤分子机制(氧化应激、线粒体损伤、炎症反应)和筛选保肝药物(如N-乙酰半胱氨酸NAC及其类似物)的黄金标准模型
  2. 缺点与注意事项:

    • 剂量敏感性: 不同品系、性别、周龄、饲养环境的小鼠对APAP敏感性存在差异。必须进行预实验确定最佳损伤剂量(足够引起显著损伤但死亡率不过高)。
    • 禁食影响: 禁食状态增强敏感性,但过度禁食本身可能导致应激或代谢紊乱。需严格控制禁食时间和饮水供应。
    • 溶剂温度: 必须预热溶解APAP,溶液冷却至室温或体温后注射,避免热刺激。
    • 死亡率: 高剂量可能导致24小时内高死亡率,需密切监控并根据动物福利准则及时处置濒死动物。NAC是APAP的特效解毒剂,可在紧急情况下使用(但会干预实验)。
    • 个体差异: 即使在同品系同性别的禁食小鼠中,仍可能存在个体差异。
    • 评价全面性: 需结合血清生化和组织病理学(金标准)进行评价,单一指标可能偏颇。
 

五、 应用领域

  1. 研究APAP肝毒性的分子机制(如氧化应激、线粒体功能障碍、炎症级联放大、细胞死亡通路)。
  2. 筛选和评价具有保肝作用的新化合物或天然产物(如抗氧化剂、抗炎剂、线粒体保护剂、GSH前体/类似物)。
  3. 研究肝脏损伤修复与再生的机制。
  4. 研究天然免疫细胞(Kupffer细胞、中性粒细胞)在药物性肝损伤中的作用。
  5. 探索个体化用药风险因素(如基因多态性对代谢酶活性的影响)。
 

总结

APAP诱导的小鼠急性肝损伤模型是研究药物性肝损伤病理生理机制和药物干预策略的核心实验平台。其成功建立依赖于对关键细节的严格控制,包括动物选择(品系、性别、禁食)、APAP溶液的准确配制与给药、以及损伤峰值的把握。通过血清酶学、组织病理学(特别是中心静脉周围坏死)、氧化应激和炎症指标等多维度综合评价,该模型能够可靠地模拟人类APAP肝毒性的核心特征,为深入理解肝损伤机制和开发新的治疗策略提供强有力的工具。研究人员应在严格遵守动物伦理规范的前提下,精心设计实验方案,确保模型的可重复性和结果的科学性。