四氯化碳(CCl₄)诱发肝纤维化模型

发布时间：2025-06-30 17:42:19 阅读量：1 作者：生物检测中心

四氯化碳(CCl₄)诱发肝纤维化模型：原理、方法与应用

一、引言

肝纤维化是多种慢性肝损伤后，肝脏组织修复过程中细胞外基质（主要是胶原蛋白）过度沉积的病理状态，是慢性肝病进展为肝硬化和肝功能衰竭的关键环节。研究肝纤维化的发生机制和防治策略需要可靠且可重复的动物模型。四氯化碳(CCl₄)诱导的肝纤维化模型是历史最悠久、应用最广泛、机制相对明确的经典实验性肝纤维化模型之一，在基础研究和药物评价中扮演着重要角色。

二、作用机制

CCl₄诱发肝纤维化的核心机制在于其肝毒性代谢产物引起的肝细胞损伤及随之而来的持续性炎症反应和星状细胞活化：

  1. 肝细胞毒性：

    • CCl₄经肝脏细胞色素P450酶系统（主要是CYP2E1）代谢，生成高活性的三氯甲基自由基(•CCl₃)和氯自由基(Cl•)。
    • 这些自由基攻击肝细胞膜和细胞器（尤其是内质网和线粒体）上的脂质分子，引发脂质过氧化链式反应，导致细胞膜结构破坏、膜通透性增加、钙离子稳态失衡。
    • 线粒体损伤导致能量代谢障碍（ATP合成减少）。
    • 最终结果是肝细胞发生变性、坏死和凋亡。

  2. 炎症反应：

    • 损伤坏死的肝细胞释放多种损伤相关分子模式（DAMPs）和细胞因子/趋化因子。
    • 这些信号募集并激活肝脏内的免疫细胞（如Kupffer细胞、中性粒细胞、单核巨噬细胞），产生大量促炎因子（如TNF-α, IL-1β, IL-6）和活性氧（ROS）。
    • 持续的炎症反应进一步扩大肝损伤范围，并刺激纤维化的发生。

  3. 肝星状细胞活化与纤维化形成：

    • 肝细胞损伤和炎症反应是肝星状细胞（HSC）活化的主要诱因。
    • 活化后的HSC表型由静止的富含维生素A脂滴的细胞转变为增殖旺盛、迁移活跃的肌成纤维样细胞。
    • 活化的HSC大量合成并分泌细胞外基质（ECM）成分，尤其是I型和III型胶原蛋白。
    • 同时，组织金属蛋白酶抑制剂（TIMPs）表达上调，抑制基质金属蛋白酶（MMPs）的活性，导致ECM降解减少。
    • ECM合成增加和降解减少的失衡，最终导致胶原纤维在肝内病理性沉积，形成肝纤维化。
 

三、模型建立方法

CCl₄模型的关键在于反复、间断给予亚致死剂量的CCl₄，模拟慢性肝损伤过程。

  1. 实验动物选择：

    • 常用动物： 大鼠（Sprague-Dawley, Wistar, Fischer 344等品系最常用）、小鼠（C57BL/6, BALB/c等）。
    • 选择依据： 大鼠对CCl₄敏感性较高，模型稳定，肝组织量大，操作相对方便，是首选；小鼠成本低，遗传背景清晰，适合基因操作研究。动物通常选用雄性，因其肝脏雌激素受体较少，对损伤更敏感（雌性雌激素有一定保护作用）。

  2. 给药途径：

    • 腹腔注射(Intraperitoneal injection, i.p.)： 最常用。吸收快、操作简便、剂量准确。
    • 皮下注射(Subcutaneous injection, s.c.)： 吸收较慢，损伤相对较轻，也可建立纤维化模型。
    • 灌胃(Gavage)： 较少用，因易造成胃肠道刺激且吸收不稳定。

  3. 溶剂与浓度：

    • CCl₄原液需用惰性油（如橄榄油、玉米油、矿物油）稀释后使用。常用稀释比例为10%-50% (v/v) CCl₄ / 油。
    • 油的选择至关重要： 需确保CCl₄充分溶解、分散均匀，且油本身无显著生物学效应。

  4. 剂量与给药方案：

    • 剂量： 因动物品系、体重、溶剂、给药频率而异。常用起始剂量（腹腔注射）：
      • 大鼠：0.5-2 ml/kg体重（如40% CCl₄ / 橄榄油）。
      • 小鼠：0.5-1 ml/kg体重（如10-20% CCl₄ / 橄榄油）。
    • 给药方案（核心）：
      • 慢性模型（最常用）： 每周1-2次，持续给药 4-12周。纤维化程度随时间延长而加重（如4周可见明显纤维间隔，8-12周可形成假小叶）。
      • 急性模型： 单次大剂量给药（常为慢性模型剂量的2倍以上），24-72小时后观察急性肝损伤（坏死、炎症），但纤维化不明显。
    • 剂量调整： 首次给药后需密切观察动物状态（体重、活动度、毛发、死亡率）。若死亡率过高或肝损伤过重，应适当降低后续剂量；若肝损伤过轻，可酌情增加。目标是维持持续的肝损伤刺激而不引起过高死亡率。

  5. 模型监测与评价：

    • 一般状态观察： 体重、活动度、毛发、精神状态、死亡率。
    • 血清生化指标：
      • 肝细胞损伤标志物： 丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)显著升高。
      • 胆汁淤积/胆管损伤标志物： 碱性磷酸酶(ALP)、γ-谷氨酰转肽酶(GGT)、总胆红素(TBIL)。
      • 肝功能合成指标： 白蛋白(ALB)、凝血酶原时间(PT) / 国际标准化比值(INR)可反映晚期纤维化/肝硬化时的肝功能储备下降。
    • 组织病理学检查（金标准）：
      • 苏木精-伊红染色(H&E)： 评估肝细胞损伤（变性、坏死、气球样变）、炎症细胞浸润、脂肪变性。
      • Masson三色染色、天狼星红染色(Sirius Red)： 特异性显示胶原纤维沉积（蓝色或红色），是评估纤维化程度的核心方法。常用半定量评分系统（如Ishak, METAVIR, Knodell评分）或图像分析软件定量胶原面积百分比。
      • 免疫组织化学/免疫荧光染色： 检测活化HSC标志物（如α-SMA）、胶原蛋白（如Collagen I, III）表达。
    • 羟脯氨酸含量测定： 羟脯氨酸是胶原蛋白的特征性氨基酸，定量测定肝组织羟脯氨酸含量能客观反映总胶原沉积量。
    • 分子生物学检测： RT-qPCR、Western Blot检测纤维化相关基因（如Collagen I, Collagen III, α-SMA, TGF-β1, TIMP-1, MMP-2, MMP-9等）的mRNA和蛋白表达水平。
 

四、模型特点与优缺点

  • 优点：

    1. 机制明确： 肝毒性、炎症、HSC活化的病理生理过程清晰，与人类多种原因（病毒、酒精、药物等）所致肝纤维化有相似之处。
    2. 可重复性好： 操作相对简单，诱导周期可控（数周），纤维化形成稳定且程度可随给药时间加重。
    3. 成本相对较低： CCl₄和实验动物成本不高。
    4. 广泛应用： 大量文献基础和成熟的评价方法，便于结果比较。
    5. 适用于干预研究： 常用于评估抗纤维化药物的疗效和机制研究。

  • 缺点与局限性：

    1. 非生理性诱因： CCl₄是化学毒物，与人类慢性肝病的常见病因（病毒、酒精、脂肪肝）存在差异。
    2. 显著的肝细胞坏死： 模型中肝细胞急性坏死非常突出，这并非所有人类肝纤维化类型（如脂肪性肝炎纤维化）的主要特征。
    3. 炎症反应强烈： 模型中强烈的炎症反应有时会掩盖或干扰对特异性抗纤维化干预效果的评价。
    4. 可逆性： 停止CCl₄刺激后，早期纤维化可部分逆转，需注意停药时间点对结果的影响。长期（如>12周）形成的肝硬化则不可逆。
    5. 动物个体差异与死亡率： 动物对CCl₄敏感性存在个体差异，需仔细调整剂量以控制死亡率（理想应<10-20%）。
    6. 肝外毒性： CCl₄对肾脏、神经系统等也有一定毒性。
 

五、重要的替代方案

为弥补CCl₄模型的不足，常结合或选用其他模型：

  • 胆管结扎(BDL)模型： 模拟胆汁淤积性肝纤维化。
  • 硫代乙酰胺(TAA)模型： 肝毒性机制与CCl₄类似，但可能更易导致肝硬化。
  • 酒精性肝病模型： Lieber-DeCarli液体饲料等，模拟酒精性肝纤维化。
  • 非酒精性脂肪性肝炎(NASH)相关纤维化模型： 蛋氨酸胆碱缺乏(MCD)饲料、高脂高胆固醇(HFHC)饲料、西方饮食(WD)等联合或加用低剂量CCl₄加速纤维化形成。
  • 遗传模型： 特定基因敲除/转基因小鼠（如db/db, ob/ob小鼠用于NAFLD/NASH背景）。
 

六、安全注意事项（至关重要）

  • CCl₄是剧毒、易挥发、致癌物质！
  • 所有操作必须在通风良好的化学通风橱中进行。
  • 操作人员必须穿戴防护服、手套（推荐双层）、护目镜和口罩/呼吸器。
  • 避免皮肤接触和吸入蒸气。
  • 妥善处理含CCl₄的废弃物（动物垫料、注射器、组织等），按危险化学废物处理规定执行。
  • 实验区域应有明确的警示标识和应急处理预案。
 

七、结论

四氯化碳(CCl₄)诱导的肝纤维化模型是研究肝纤维化发生机制、病理生理过程和评估抗纤维化药物疗效的经典工具。其机制明确、方法相对成熟、可重复性好。然而，研究者必须充分认识其局限性（非生理性诱因、显著坏死、强烈炎症），并严格遵守安全操作规程。通常需要结合具体的研究目的（如模拟何种病因的纤维化、侧重何种病理过程），选择合适的模型（单一或复合模型），并利用多种指标（血清学、组织学、分子生物学）进行综合评价，才能获得更可靠、更贴近人类疾病的研究结果。