大鼠或小鼠糖尿病伤口愈合模型

大鼠/小鼠糖尿病伤口愈合模型：标准化流程与应用

该模型是研究糖尿病状态下伤口愈合障碍机制及评估新型治疗策略的核心实验工具。以下为构建该模型的标准化流程与关键要点：

一、 核心价值

• 模拟病理状态： 再现糖尿病特征性的高血糖、炎症失调、血管新生受损、胶原沉积异常等关键病理生理改变。
• 机制研究平台： 阐明高血糖、晚期糖基化终末产物、氧化应激、炎症因子级联反应等在愈合延迟中的作用。
• 治疗评估桥梁： 为开发新型敷料、生长因子、药物、细胞疗法或基因疗法提供临床前疗效和安全性评价依据。

二、 实验动物选择与管理

1. 品系选择：
   • 大鼠： SD (Sprague Dawley)、Wistar 常用，体型较大，便于手术操作和多次取样。
   • 小鼠： C57BL/6 最常用（因其对链脲佐菌素诱导的糖尿病敏感性相对较高）， BALB/c 亦可用。体型小，成本低，遗传背景清晰。
   • 性别与年龄： 通常选用成年雄性动物（雌性激素对愈合有潜在影响，需控制变量）。常用体重范围：大鼠 200-250g；小鼠 20-25g。
2. 饲养环境：
   • 标准 SPF 级动物房饲养。
   • 恒温 (22±2°C)、恒湿 (50±10%)、12小时明暗循环。
   • 自由饮水、摄食标准实验室饲料（除非实验设计特殊要求）。
3. 适应性饲养： 动物购入后需适应环境至少 5-7 天。

三、 糖尿病诱导

1. 方法选择： 化学诱导法（链脲佐菌素 STZ）是最常用、经济、可靠的方案。
2. 链脲佐菌素 (STZ) 诱导流程 (以小鼠为例，大鼠剂量通常按体重增加)：
   • 原理： STZ选择性破坏胰岛β细胞，导致胰岛素分泌绝对或相对不足。
   • 准备：
     • STZ 粉末需新鲜配制溶液：溶于预冷的 0.1 M 柠檬酸钠缓冲液 (pH 4.2-4.5)。
     • 配制后需立即使用或在冰上避光保存 (<30 分钟)。
     • 动物空腹 4-6 小时（提高 STZ 对 β 细胞毒性）。
   • 给药：
     • 小鼠： 常用剂量范围为 50-70 mg/kg 体重。一次性腹腔注射或连续 5 天腹腔注射较低剂量（如 40-50 mg/kg/day）。
     • 大鼠： 常用剂量范围为 45-65 mg/kg 体重。一次性腹腔注射或较低剂量多次注射。
   • 血糖监测与模型确认：
     • 注射后 72 小时，尾尖采血测量随机血糖。
     • 血糖 ≥ 16.7 mmol/L (300 mg/dL) 作为糖尿病模型成功的标准。
     • 此后定期监测血糖（如每周一次），确保高血糖持续稳定。
   • 注意事项：
     • STZ 具肾毒性，需严格掌握剂量和动物状态。
     • 部分动物可能死亡（尤其在初始剂量摸索阶段）。
     • 监测饮水、排尿、体重变化（糖尿病初期可能出现多饮多尿、体重下降）。
     • 提供充足饮水和饲料。

四、 伤口模型建立

1. 伤口类型选择：
   • 全层皮肤切除伤口 (Excisional Wound)： 最常用，易于标准化和量化。
     • 圆形切除： 使用皮肤打孔器（直径：小鼠 6-8 mm，大鼠 10-12 mm）。优点：创缘光滑、一致性好、愈合过程明确（从创缘向中心收缩+上皮再生）。
     • 方形切除： 使用手术刀和尺子标记切割。操作难度稍大，测量需更精确。
   • 切口伤口 (Incisional Wound)： 主要用于研究伤口抗张强度（需后期处死取材进行拉力测试）。
2. 手术操作流程 (以背部圆形全层切除伤口为例)：
   • 术前准备：
     • 动物术前禁食 4-6 小时（非必需，但减少麻醉风险）。
     • 称重。
     • 麻醉：常用吸入麻醉（异氟烷/七氟烷）或腹腔注射麻醉复合剂（如氯胺酮/赛拉嗪混合物）。确保麻醉深度足够（无痛觉反射）。
     • 备皮：手术区域（通常为背部中线两侧）剃毛，范围大于伤口直径数倍。
     • 皮肤消毒：碘伏或洗必泰溶液交替消毒数次（脱碘）。
   • 伤口制作：
     • 使用灭菌的皮肤打孔器，垂直、快速、均匀用力穿透皮肤全层（包括表皮、真皮、皮下筋膜），直达但不损伤下方的肌肉层。
     • 用精细镊子和小剪刀小心移除圆形皮瓣，确保创面边缘整齐，无残留毛囊和皮下组织。
     • 彻底止血（纱布轻压或必要时电凝微小出血点）。
     • 创面通常不做缝合或覆盖（开放创面模型），以模拟慢性难愈性溃疡。若研究特定敷料/药物，可在此时施加。
   • 术后护理：
     • 动物单笼饲养至完全清醒，防止互舔伤口。
     • 保暖。
     • 观察动物状态（活动、食欲、饮水）。
     • 伤口区域通常无需特殊包扎（除非研究需要），保持开放干燥。

五、 伤口愈合评估

评估需结合宏观和微观指标，多时间点动态监测（如造伤后第 0, 3, 7, 10, 14, 21 天）。

1. 宏观指标：
   • 创面面积测量：
     • 数码照相法： 最常用。固定相机高度、角度、光源（推荐环形光源）。动物需麻醉后固定于标准位置。伤口旁放置已知尺寸的标尺。
     • 图像分析软件： 导入照片，手动或半自动勾画创面边缘，软件计算面积（像素转换实际面积 mm²）。
     • 愈合率计算： (初始创面面积 - 某时间点创面面积) / 初始创面面积 × 100%。
     • 愈合时间： 创面完全闭合（上皮覆盖，无肉眼可见肉芽组织外露）所需天数。
   • 创面观察： 记录肉芽组织形成颜色、质地、渗出物（脓性、血清性）、有无坏死、感染迹象等。
2. 微观指标（需处死动物取材）：
   • 组织学检查 (H&E 染色)：
     • 评估再上皮化程度（新生表皮覆盖创面的百分比）。
     • 炎症细胞（中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞）浸润程度与动态变化。
     • 肉芽组织厚度、新生血管密度。
     • 胶原沉积（需特殊染色如 Masson’s Trichrome 或天狼星红评估）。
   • 免疫组织化学/免疫荧光 (IHC/IF)：
     • 检测关键蛋白表达定位：如血管内皮标志物 (CD31, CD34) 评估血管新生，增殖细胞核抗原 (PCNA) 或 Ki67 评估细胞增殖，α-SMA 评估肌成纤维细胞分化，炎症因子 (TNF-α, IL-1β, IL-6)，生长因子 (VEGF, TGF-β, PDGF) 等。
   • 羟脯氨酸含量测定：
     • 羟脯氨酸是胶原蛋白特征性氨基酸。定量分析创面组织或周边组织的羟脯氨酸含量，反映胶原合成总量（总胶原沉积）。
   • 分子生物学分析 (qPCR, Western Blot)：
     • 提取创面组织总 RNA 或蛋白。
     • 检测炎症因子、生长因子、基质金属蛋白酶及其抑制剂、胶原相关基因、氧化应激相关基因等的 mRNA 或蛋白表达水平变化。
   • 伤口拉力强度测定 (仅适用于切口模型)：
     • 在特定时间点处死动物，取包含切口及其两侧正常组织的皮条。
     • 使用拉力测试仪器测量伤口断裂所需的最大拉力（单位：N 或 g），反映愈合组织的机械强度（胶原成熟交联程度）。

六、 模型特点与注意事项

• 优点：
  • 相对经济、高效。
  • 可高度标准化操作和评估。
  • 遗传背景可控。
  • 便于进行干预研究和机制探索（取样方便）。
• 局限性：
  • 啮齿类动物皮肤结构（如疏松皮下组织、皮肌层）和愈合方式（以收缩为主）与人类存在差异。
  • 难以完全模拟人类糖尿病慢性溃疡的复杂病因（如长期血管病变、神经病变）。
  • STZ 诱导的 1 型糖尿病模型占主导，与临床更常见的 2 型糖尿病病理背景不完全等同（可考虑使用 db/db 或 ob/ob 基因缺陷小鼠模拟 2 型）。
• 关键注意事项：
  • 伦理审批： 所有动物实验必须获得机构动物伦理委员会批准，遵循“3R”原则。
  • 严格无菌操作： 最大限度减少手术感染对愈合过程的干扰。
  • 标准化： 麻醉、造模位置、伤口大小、测量方法必须高度一致。
  • 血糖控制： 确保糖尿病模型稳定，高血糖贯穿整个实验周期。设置糖尿病非伤口组、正常血糖伤口组作为对照至关重要。
  • 样本量： 根据预期的效应量和统计检验力计算合理的每组动物数量。
  • 动物福利： 密切监测动物状态，必要时给予镇痛，设定人道终点。

七、 数据分析

• 使用合适的统计软件进行分析。
• 连续变量（如创面面积、愈合率、羟脯氨酸含量、基因表达量）通常采用重复测量方差分析比较组间差异和时间效应。
• 分类变量或等级资料采用非参数检验。
• P < 0.05 通常认为具有统计学显著性。
• 图表清晰展示结果（带误差线的趋势图、柱状图等）。

结论

大鼠和小鼠糖尿病伤口愈合模型是深入研究糖尿病相关伤口愈合障碍病理生理过程和筛选评估潜在治疗方法的不可或缺的临床前工具。其成功建立依赖于精确的糖尿病诱导（如 STZ 应用）、标准化的伤口制作手术以及全面、客观的多维度愈合评估体系。严格遵守动物福利和实验设计规范是获得可靠、可重复性结果的基础。该模型为将实验室发现转化为改善糖尿病足溃疡等慢性伤口临床结局提供了重要桥梁。

参考文献 (示例类型，需根据实际引用更新)

1. Brem, H., & Tomic-Canic, M. (2007). Cellular and molecular basis of wound healing in diabetes. The Journal of clinical investigation, 117(5), 1219–1222.
2. Grada, A., Mervis, J., & Falanga, V. (2018). Research Techniques Made Simple: Animal Models of Wound Healing. The Journal of investigative dermatology, 138(10), 2095–2105.e1.
3. Wong, S. L., Demers, M., Martinod, K., et al. (2015). Diabetes primes neutrophils to release NETs, which contribute to impaired wound healing. Nature medicine, 21(7), 815–819. (注重机制研究的范例)
4. Galiano, R. D., Michaels, J., Dobryansky, M., et al. (2004). Quantitative and reproducible murine model of excisional wound healing. Wound repair and regeneration, 12(4), 485–492. (标准化手术方法)
5. [具体描述STZ诱导糖尿病方法的经典文献]
6. [具体描述某种评估方法如图像分析的文献]

请注意： 此模板提供了一个通用的、详尽的框架。实际撰写完整文章时，需根据具体的研究目的（如机制探索、药物评价）、使用的特定动物品系和伤口模型类型、以及所采用的独特评估方法，对相应部分进行更深入的阐述和数据填充，并引用最相关和最新的文献。务必确保所有操作细节描述清晰，使实验具有可重复性。