Arachidonic Acid-induced ear edema in ICR mice

发布时间：2025-06-30 15:36:15 阅读量：2 作者：生物检测中心

花生四烯酸诱导ICR小鼠耳水肿模型的建立与应用

摘要：
花生四烯酸（AA）诱导的小鼠耳水肿模型是评估抗炎药物局部疗效的标准方法之一。该模型利用AA及其代谢产物（前列腺素、白三烯等）的强效促炎作用，在ICR小鼠耳部快速诱发急性炎症反应，主要表现为显著的耳组织肿胀、炎性细胞浸润。本模型操作简便、重复性好、与人类皮肤炎症有相似的病理机制，广泛应用于抗炎药物（尤其是环氧化酶、脂氧合酶抑制剂）的初步筛选和作用机制研究。

一、 引言
炎症是机体对有害刺激的防御反应，但过度或持续的炎症会导致组织损伤和疾病。皮肤作为人体最大的器官，常发生接触性皮炎等炎症性疾病。开发可靠、易操作的动物炎症模型对研究炎症机制和筛选抗炎药物至关重要。

花生四烯酸（Arachidonic Acid, AA）是细胞膜磷脂的重要成分，在磷脂酶A2作用下释放。AA经环氧化酶（COX）途径代谢产生前列腺素类物质（如PGE2、PGD2），经脂氧合酶（LOX）途径代谢产生白三烯类物质（如LTB4）。这些代谢产物是强效的炎症介质，能诱导血管扩张、通透性增加（导致水肿）、白细胞趋化和活化（导致浸润）、痛觉过敏等一系列炎症反应。

基于此原理，局部应用AA至小鼠耳廓可快速、特异地模拟急性皮肤炎症的核心病理特征——水肿和细胞浸润，成为评估局部抗炎药物（特别是针对AA代谢通路药物）效力的经典模型。

二、 材料与方法

  1. 实验动物：

    • 品系：雄性ICR小鼠（远交系小鼠，实验重复性好）。
    • 年龄/体重：通常选用6-8周龄，体重18-22克。
    • 饲养条件：标准实验动物房环境（温度22±2°C，相对湿度50±10%，12/12小时光照/黑暗循环），自由饮水和摄食。
    • 适应期：实验前至少饲养适应5-7天。
    • 分组：根据实验设计随机分组（如模型对照组、阳性药对照组、待测药物不同剂量组），每组通常6-10只动物。

  2. 试剂与仪器：

    • 主要试剂：
      • 花生四烯酸（AA）：分析纯。常用溶剂为丙酮（分析纯）。
      • AA溶剂：丙酮（分析纯）或丙酮-生理盐水混合液（体积比通常为1:4或1:3）。丙酮作为溶剂有利于AA溶解和在皮肤上的渗透。
      • 阳性对照药：常用吲哚美辛（Indomethacin）或酮洛芬（Ketoprofen）等已知强效COX抑制剂，溶解于适当溶剂（如生理盐水或含少量助溶剂的生理盐水）。
      • 待测药物：根据其性质溶解于生理盐水、蒸馏水、乙醇、丙酮或其它适当溶剂/载体中。对照组给予等容积溶剂。
    • 主要仪器：
      • 电子天平（精度0.1mg，用于称量AA）
      • 微量移液器（20μL规格）
      • 小鼠耳厚度测量仪（测厚规）
      • 手术剪、镊子
      • 匀浆器（用于组织样本处理）
      • ELISA试剂盒（用于检测炎症因子如TNF-α, IL-1β, PGE2等，可选）
      • 组织病理学处理设备（固定液、包埋、切片机、染色设备等，可选）

  3. 实验步骤：

    • 准备AA溶液： 精确称量AA粉末，用丙酮或丙酮-生理盐水混合液溶解，配制成所需浓度（通常为0.5mg/耳至2.0mg/耳，常用浓度为1-2mg/耳）。现配现用或避光、氮气保护下短暂储存于-20°C。
    • 耳部给药：
      1. 实验当天，小鼠称重并记录。
      2. 确定小鼠左耳为处理耳，右耳通常不做处理作为自身对照（或仅涂溶剂作为对照）。
      3. 用微量移液器吸取规定体积（通常为单一剂量20μL）的AA溶液，均匀涂抹在小鼠左耳廓的内外两侧表面。注意避免溶液流出耳廓范围。
      4. 对于待测药物的局部给药：
        • 预防性给药： 在AA诱导前一段时间（如30分钟、1小时），将待测药物溶液或阳性药溶液同样以20μL剂量涂抹在同侧（左）耳廓上。待溶剂挥发后（通常数分钟），再涂抹AA溶液。
        • 治疗性给药： 在AA诱导后一段时间（如立即、30分钟），涂抹药物。
      5. 溶剂对照组在左耳涂抹等体积的溶剂（丙酮或丙酮-生理盐水）。
      6. 给药后让溶剂自然挥发干燥（约1-2分钟）。
    • 诱导水肿与炎症： 小鼠在给药后置于鼠笼中正常饲养。
    • 指标检测：
      • 耳肿胀度（主要指标）：
        1. 在AA诱导后特定时间点（常用4小时，此时间点水肿达到峰值）测量耳厚度。
        2. 使用耳厚度测量仪（测厚规），轻柔固定小鼠头部，将耳廓置于测量仪钳口之间，轻轻合拢至接触耳廓但避免挤压，读取厚度值。每只耳朵至少测量3次不同位置，取平均值。
        3. 计算耳肿胀度：
          • 耳肿胀度 = 致炎后处理耳平均厚度 - 致炎前同一耳平均厚度
          • 或 耳肿胀度 = 致炎后处理耳平均厚度 - 致炎后对侧（右）耳平均厚度（右耳作为自身对照）
      • 耳重（辅助指标，通常在处死动物后测量）：
        1. 在测量完耳厚度后（如AA诱导后4小时），迅速处死小鼠（如颈椎脱臼）。
        2. 用锋利的手术剪沿耳廓根部剪下双侧耳廓（左耳为处理耳，右耳为对照耳）。
        3. 取直径相同的耳组织圆片（通常直径6mm或8mm），可使用专业打孔器在耳朵相同位置取样。
        4. 立即用电子天平称量左右耳圆片的湿重（毫克）。
        5. 计算耳肿胀重量：
          • 耳肿胀重量 = 处理耳圆片湿重 - 对照耳圆片湿重
      • 组织病理学检查（可选）：
        1. 取耳组织样本（不限于圆片）放入10%中性福尔马林缓冲液中固定。
        2. 常规石蜡包埋、切片（厚度约5μm）。
        3. 苏木精-伊红（H&E）染色。
        4. 光学显微镜下观察并评估：表皮和真皮层厚度变化、水肿程度（真皮层间隙增宽）、炎性细胞（主要是中性粒细胞）浸润的数量和密度、血管扩张充血情况等。可进行半定量评分。
      • 炎症因子检测（可选）：
        1. 取耳组织样本（不限于圆片），迅速置于冰上。
        2. 加入适量预冷的缓冲液（如含蛋白酶抑制剂的PBS）。
        3. 充分匀浆。
        4. 离心取上清液。
        5. 使用ELISA等方法检测上清液中关键炎症因子（如TNF-α, IL-1β, IL-6, PGE2, LTB4等）的浓度。

  4. 数据分析：

    • 数据以均数±标准差（Mean ± SD）表示。
    • 使用统计软件（如GraphPad Prism, SPSS）进行统计分析。
    • 组间比较通常采用单因素方差分析（One-way ANOVA），若方差齐性则用LSD法或Dunnett's T3法进行事后多重比较；若方差不齐，则用非参数检验（如Kruskal-Wallis test），事后比较用Dunn's test。以P<0.05为差异具有统计学意义。
    • 计算抑制率：
      • 抑制率 (%) = [(对照组肿胀度均值 - 药物组肿胀度均值) / 对照组肿胀度均值] × 100%
 

三、 结果与讨论

  1. 典型结果：

    • 耳肿胀度/重量： AA诱导后，模型对照组小鼠处理耳显著肿胀。通常在1小时后肿胀开始明显，2-4小时达到高峰，之后逐渐消退。在诱导后4小时，模型对照组耳肿胀度或肿胀重量显著高于溶剂对照组和空白对照组（如有）。
    • 组织病理学： 模型对照组耳组织呈现典型的急性炎症病理改变：表皮可有轻度增厚；真皮层显著水肿（胶原纤维间隙增宽）；大量中性粒细胞浸润；血管扩张、充血。
    • 炎症因子： 模型对照组耳组织中PGE2、LTB4、TNF-α、IL-1β等关键炎症因子的水平显著升高。
    • 药物效应： 阳性对照药（如吲哚美辛，局部或系统给药）能显著抑制AA诱导的耳肿胀和组织病理学损伤，降低炎症因子水平。有效的待测药物也会显示出剂量依赖性的抑制作用。

  2. 模型优缺点讨论：

    • 优点：
      • 操作简便快捷： 诱导过程简单，指标测量方便，可在短时间内（数小时）获得结果，适合高通量初筛。
      • 病理机制明确： 直接模拟了花生四烯酸代谢通路（COX/LOX）激活导致的炎症反应核心事件（水肿、中性粒细胞浸润），机制清晰，特别适合评价作用于该通路的药物（NSAIDs, LOX抑制剂）。
      • 重复性好： ICR小鼠个体差异相对较小，模型稳定性较高。
      • 局部反应： 可直接评价药物的局部抗炎效果。
    • 缺点与局限性：
      • 急性模型： 主要反映急性炎症早期事件（水肿、中性粒细胞浸润），对慢性炎症或淋巴细胞介导的炎症过程模拟不足。
      • 作用靶点集中： 主要针对AA-COX/LOX通路，对炎症其他通路（如细胞因子网络、补体系统）的覆盖相对有限。
      • 溶剂影响： 丙酮作为溶剂具有一定的刺激性，溶剂对照组的轻微反应可能需要考虑。
      • 种属差异： 啮齿类动物皮肤结构与人类存在差异。
 

四、 结论

花生四烯酸诱导的ICR小鼠耳水肿模型是一种可靠、成熟且广泛应用的急性皮肤炎症模型。它通过局部激活AA代谢途径，在短时间内（数小时）诱发以水肿和中性粒细胞浸润为主的显著炎症反应。该模型操作简便、结果直观、重复性好，特别适用于评价具有抗炎活性的化合物（尤其是靶向COX和LOX通路的药物）的局部疗效，是药物研发早期进行抗炎活性筛选的重要工具。结合组织病理学和炎症因子检测，可更全面地评估药物的抗炎效果和作用机制。研究者需充分理解该模型的优缺点及其所反映的特定炎症通路，合理应用于抗炎药物的评价体系中。

五、 实验动物伦理声明

本研究所有动物实验操作均严格按照国家或地区关于实验动物管理和使用的法律法规以及相关机构（如大学动物实验伦理委员会）批准的伦理指南执行。实验方案已提交并获得实验动物伦理委员会审查批准（批件号：XXXX）。在整个实验过程中，尽最大努力遵循“3R原则”（替代、减少、优化），尽量减少动物使用数量，优化实验操作以减轻动物痛苦，并提供适宜的饲养环境和人道终点关怀。

补充说明：

  • 剂量与溶剂： AA最佳诱导剂量（如1mg/耳）和溶剂比例（如丙酮：生理盐水=1:4）需根据预实验确定，以达到足够肿胀且溶剂本身影响最小。不同来源的ICR小鼠可能对AA敏感性略有差异。
  • 测量技巧： 耳厚度测量需轻柔、稳定且位置一致，由同一操作者在动物安静状态下完成，以减少误差。
  • 阳性药选择： 吲哚美辛是经典的COX抑制剂阳性对照，常通过腹腔注射（如5mg/kg）或局部给药（如0.5-1mg/耳）给药进行验证。
  • 时间点选择： 4小时是评估水肿的经典时间点。若需评估细胞浸润动态变化，可选择不同时间点（如1h、2h、4h、6h、8h）。
  • 组织病理定量： 可制定半定量评分标准对水肿程度和炎性细胞浸润进行评分（如0-4分）。
 

这篇完整文章详细描述了花生四烯酸诱导ICR小鼠耳水肿模型的原理、方法、操作步骤、结果分析、模型特点及伦理考量，严格避免了任何企业名称，符合学术规范和研究报告的要求。