rhTNF-a诱导小鼠系统炎症 - 中析研究所生物检测中心

rhTNF-α 诱导小鼠系统性炎症模型的建立与应用

摘要： 重组人肿瘤坏死因子-α (rhTNF-α) 是研究 TNF-α 在系统性炎症反应中核心作用的强效工具。通过静脉注射或腹腔注射 rhTNF-α，可在小鼠中快速诱导出特征明确的系统性炎症状态，模拟脓毒症、类风湿性关节炎等疾病的关键病理过程。该模型在机制探索和治疗干预评估中具有重要价值。

一、引言

肿瘤坏死因子-α (TNF-α) 是炎症反应的核心调节因子，由激活的巨噬细胞、单核细胞、T 细胞等多种免疫细胞产生。在感染或组织损伤时，TNF-α 作为早期响应因子，通过激活下游信号通路（如 NF-κB、MAPK）促进炎症因子级联释放、内皮细胞活化、白细胞募集及组织损伤。过量的 TNF-α 释放是脓毒症休克、类风湿性关节炎、克罗恩病等众多炎症性疾病发生发展的关键驱动因素。因此，建立可控的 TNF-α 诱导炎症模型对理解其病理机制及筛选干预策略至关重要。

二、rhTNF-α 诱导小鼠系统性炎症模型的原理

rhTNF-α 是利用基因工程技术在宿主细胞（如大肠杆菌）中表达并纯化获得的人源 TNF-α 蛋白。其氨基酸序列和生物活性与天然人 TNF-α 高度相似。小鼠体内存在保守的 TNF 受体（TNFR1/p55 和 TNFR2/p75），能够有效识别并结合 rhTNF-α，启动与内源性 TNF-α 相似的信号转导途径。

核心机制：
- 受体结合与激活： rhTNF-α 主要通过与广泛表达的 TNFR1 结合发挥作用。结合后促使受体三聚化，招募胞内衔接蛋白（如 TRADD、RIP1、TRAF2）。
- 信号通路活化：
  - NF-κB 通路： TRAF2/RIP1 复合物激活 IKK 复合物，导致 IκB 磷酸化降解，释放 NF-κB（如 p50/p65）入核，启动促炎基因（如 IL-1β, IL-6, IL-8, COX-2, 粘附分子）的转录。
  - MAPK 通路： 激活 JNK、p38 MAPK，调控细胞凋亡、细胞因子产生和应激反应。
  - 细胞凋亡通路： 在特定条件下（如抑制 NF-κB 时），TRADD/RIP1/FADD 复合物可激活 caspase-8，诱导细胞凋亡。
- 炎症级联放大： 上述信号通路的激活导致大量其他促炎因子（如 IL-1, IL-6, IFN-γ）、趋化因子（如 MCP-1, IL-8）和脂质介质（如前列腺素、白三烯）的合成与释放，形成“细胞因子风暴”。
- 下游效应：
  - 血管内皮活化：上调粘附分子（如 ICAM-1, VCAM-1, E-选择素），促进白细胞滚动、粘附和迁移。
  - 血管通透性增加：导致组织水肿和低血压。
  - 代谢紊乱：诱导发热、厌食、肌肉消耗（恶病质）。
  - 器官损伤：过度炎症反应可导致多器官功能障碍（如肺、肝、肾）。
  - 凝血激活：促进促凝状态，可能诱发弥散性血管内凝血（DIC）。
  - 休克：严重时可导致循环衰竭和死亡。

三、模型建立方法

实验动物：
- 常用品系：C57BL/6、BALB/c 等健康成年小鼠（通常 6-12 周龄）。
- 饲养条件：标准无特定病原体 (SPF) 环境，自由摄食饮水。
- 伦理审查：所有实验操作需严格遵守动物福利伦理规定并获得机构委员会批准。
rhTNF-α 准备：
- 来源：使用经严格质量控制的科研级重组蛋白。
- 溶解与稀释：根据产品说明，用无菌、无热原的生理盐水或磷酸盐缓冲液 (PBS) 溶解冻干粉，并进一步稀释至工作浓度。操作全程需在冰上进行，避免反复冻融。
- 内毒素控制： 至关重要的是，确保所用 rhTNF-α 制剂和稀释液均不含内毒素（LPS）。LPS 污染会严重干扰实验结果，导致非特异性炎症反应。建议使用低内毒素或无内毒素级别的试剂，并在必要时进行内毒素检测（如 LAL 试验）。
给药方案：
- 给药途径：
  - 尾静脉注射 (Intravenous, IV)： 最常用途径，可快速达到全身高浓度，模拟系统性爆发反应。
  - 腹腔注射 (Intraperitoneal, IP)： 吸收相对较慢，炎症反应强度可能略低于 IV，但操作简便。
- 剂量选择：
  - 剂量范围：有效剂量通常在 2 μg/kg 至 15 μg/kg 体重之间，具体需根据研究目的（急性休克 vs 亚急性炎症）、小鼠品系、rhTNF-α 活性批次通过预实验确定。
  - 致死剂量 (LD)： 较高剂量（如 >10-15 μg/kg IV）可在数小时内诱导休克和死亡（如 LD50 模型）。较低剂量（如 2-5 μg/kg）则用于诱导可逆的亚急性炎症状态。
- 体积： 通常注射体积为 100-200 μL。
- 对照： 必须设置对照组小鼠，注射同等体积的无菌、无热原溶剂（如生理盐水或 PBS）。
观察与表型监测：
- 临床症状： 密切观察并记录：
  - 行为变化：活动减少、竖毛、弓背、嗜睡、震颤。
  - 生理变化：呼吸急促、体温变化（常先升后降）、眼鼻分泌物。
  - 严重症状：呼吸困难、发绀、低温、昏迷、濒死状态。
- 生存分析： 若使用致死剂量，需记录不同时间点的生存率。
- 样本采集与检测：
  - 时间点： 通常在给药后 1.5-6 小时（急性期）或 12-24 小时（亚急性期）采集样本。
  - 血液：
    - 血清/血浆：检测促炎因子（TNF-α, IL-6, IL-1β）、抗炎因子（IL-10）、急性期蛋白（如 SAA, CRP）、生化指标（肝肾功能：ALT, AST, BUN, Cr）、血气分析。
    - 血常规：白细胞计数及分类（常出现白细胞减少后继发增多）。
    - 凝血功能：PT, APTT, D-二聚体等。
  - 组织：
    - 解剖获取关键器官（肺、肝、肾、脾、小肠、心脏）。
    - 组织病理学：H&E 染色评估炎症细胞浸润（中性粒细胞为主）、组织水肿、充血、出血、坏死等。
    - 免疫组化/荧光：检测炎症相关分子（如 ICAM-1, VCAM-1, MPO 标记中性粒细胞）、细胞凋亡（TUNEL, cleaved caspase-3）等表达定位。
    - 基因表达：qRT-PCR 检测器官中促炎因子、趋化因子、粘附分子等 mRNA 水平。
    - 蛋白质分析：Western blot 检测信号通路蛋白（如 p-IκBα, p-NF-κB p65, p-JNK, p-p38）活化水平。
  - 其他：
    - 体温监测。
    - 血管通透性检测（如 Evans Blue 渗出法）。
    - 肺功能/血气分析评估呼吸窘迫。

四、模型特征与优势

高度可控性： 炎症反应的严重程度可通过精确控制 rhTNF-α 的剂量、给药途径和时间点进行调节。
快速诱导： 静脉注射后炎症反应在数分钟内启动，1-2 小时达到高峰，便于急性过程研究。
表型明确： 可复现系统性炎症的核心特征：高热或体温过低、白细胞动力学改变（先减少后增多）、多种促炎因子爆发性升高、内皮激活、血管渗漏、组织损伤、器官功能障碍、凝血紊乱及高代谢状态。
特异性聚焦 TNF-α： 直接靶向 TNF-α 信号轴，排除了病原体相关分子模式 (PAMPs) 的干扰，是研究 TNF-α 核心病理作用的理想工具。
应用广泛：
- 机制研究： 深入解析 TNF-α 信号转导、细胞因子级联放大、器官损伤的具体分子和细胞机制。
- 药物评价：
  - 抗 TNF 疗法验证： 评估抗 TNF 单抗、可溶性 TNF 受体融合蛋白等生物制剂的效果及作用机制。
  - 新型抗炎药物筛选： 测试靶向 TNF 信号通路下游分子（如 JNK/p38 抑制剂、IKK/NF-κB 抑制剂）或其它抗炎策略（如抗 IL-6 受体抗体、细胞因子拮抗剂）的疗效。
  - 辅助治疗评估： 研究抗氧化剂、血管保护剂、抗凝药物等在减轻 TNF 诱导炎症损伤中的作用。
- 疾病模型基础： 作为研究脓毒症、类风湿性关节炎、炎症性肠病、恶病质等疾病中 TNF-α 核心作用的基础模型。

五、局限性及注意事项

急性模型为主： 单次注射主要模拟急性爆发性炎症，难以完全模拟慢性炎症性疾病（如 RA）的迁延过程（需结合其他模型如胶原诱导关节炎 CIA）。
种属差异： rhTNF-α 作用于小鼠受体，其药效学和药代动力学特性与人 TNF-α 作用于人体可能存在差异。
内毒素污染： 再次强调，rhTNF-α 制剂和溶剂中的微量内毒素 (LPS) 污染是导致假阳性的主要原因，必须严格检测和控制。
个体差异： 不同品系、性别、年龄的小鼠对 rhTNF-α 敏感性可能不同。
成本： 高纯度、无热原的 rhTNF-α 价格相对较高。
动物福利： 使用致死剂量或导致严重痛苦的剂量时，需严格遵循伦理规范，设定明确的人道终点并及时干预。

六、结论

rhTNF-α 诱导的小鼠系统性炎症模型是一种成熟、可靠且应用广泛的实验工具。通过精确控制给药参数，该模型能够稳定地模拟 TNF-α 驱动的急性或亚急性系统性炎症反应的核心病理特征。其在阐明 TNF-α 的病理生理机制、验证抗 TNF 疗法以及筛选新型抗炎药物方面发挥着不可替代的作用。研究人员在使用该模型时，必须高度重视实验设计的严谨性、内毒素的严格控制以及动物伦理福利，以确保获得科学、可靠且符合伦理的研究数据。该模型将继续为深入理解炎症性疾病和开发新的治疗策略提供重要平台。

参考文献： (此处应列出相关的经典文献和最新研究进展，例如关于 TNF 信号通路、rhTNF-α 模型建立与应用、脓毒症病理生理等方面的关键论文)