卵白蛋白诱导大鼠急性Arthus反应

发布时间：2025-06-30 14:55:43 阅读量：1 作者：生物检测中心

卵白蛋白诱导大鼠急性Arthus反应模型建立与应用

摘要：
急性Arthus反应是经典的Ⅲ型超敏反应模型，其特征为局部免疫复合物沉积引发的剧烈炎症反应。本文详细阐述利用卵白蛋白（Ovalbumin, OVA）联合弗氏完全佐剂（CFA）免疫SD大鼠，并通过局部抗原攻击成功诱导急性Arthus反应的标准实验流程，涵盖模型建立、评价指标及理论机制。

一、引言
Ⅲ型超敏反应由可溶性抗原-抗体复合物（免疫复合物，IC）在血管壁或组织间隙沉积引发，激活补体系统，招募中性粒细胞，导致局部组织损伤。Arthus反应（1903年由Maurice Arthus发现）是该反应的经典动物模型，表现为抗原注射部位的红斑、水肿、出血和坏死。卵白蛋白（OVA）因其良好的免疫原性和易获得性，成为诱导该模型的常用抗原。

二、实验材料

  1. 实验动物： 健康成年Sprague Dawley (SD) 大鼠，雄性，体重180-220g，常规饲养。
  2. 抗原与佐剂：
    • 卵白蛋白 (OVA)：纯度≥98%。
    • 弗氏完全佐剂 (CFA)：含热灭活分枝杆菌。
  3. 主要试剂： 磷酸盐缓冲液 (PBS, pH 7.4)，麻醉剂（如戊巴比妥钠），多聚甲醛固定液，石蜡包埋试剂，苏木素-伊红（H&E）染色试剂，伊文思蓝（Evans Blue）染料。
  4. 主要仪器： 微量注射器，电子天平，组织匀浆器，分光光度计，石蜡切片机，光学显微镜，游标卡尺。
 

三、实验方法

  1. 动物致敏：

    • 将OVA溶解于PBS，终浓度为10 mg/mL。
    • 取等体积OVA溶液与CFA充分乳化，形成油包水乳剂（滴入水中不扩散）。
    • 大鼠背部皮下多点注射（通常4点），每点注射乳剂0.1 mL（含OVA 0.5 mg）。此为初次免疫。

  2. 加强免疫（可选，增强反应）：

    • 初次免疫后7-14天，可于背部另一区域皮下多点注射OVA/CFA乳剂（剂量同初次免疫或减半）进行加强。

  3. 局部抗原攻击（诱导Arthus反应）：

    • 初次免疫后14-21天（或加强免疫后7天），大鼠腹腔注射麻醉。
    • 选择背部（避开致敏注射点）或足垫作为攻击部位。
    • 将OVA溶解于PBS（浓度通常为5-20 mg/mL）。
    • 使用微量注射器，在选定部位皮内注射OVA溶液50-100 μL（含OVA 0.25-2 mg）。同时设立对照组（仅注射等体积PBS）。

  4. 反应观察与评价：

    • 临床表现： 攻击后1小时至数天内，定期观察注射部位的红斑、水肿、硬结、出血及坏死情况。
    • 水肿程度定量：
      • 足垫厚度： 攻击前及攻击后不同时间点（如2h, 4h, 6h, 24h），使用游标卡尺精确测量足垫厚度。水肿程度以攻击后厚度减去攻击前厚度表示。
      • 背部皮肤： 攻击后预定时间点（如4-6h），处死动物，取攻击部位皮肤组织（直径约1cm），精确称重（湿重）。部分组织可于60°C烘箱干燥至恒重，称取干重。水肿程度以组织湿重/干重比值或单位面积湿重表示。
    • 血管通透性测定（伊文思蓝渗出法）：
      • 抗原攻击前15-30分钟，大鼠尾静脉注射1%伊文思蓝溶液（溶于生理盐水），剂量为1 mL/100g体重。
      • 攻击后预定时间点（如30min, 1h, 2h, 4h），处死动物。
      • 取攻击部位皮肤组织（含注射中心），剪碎后浸泡于甲酰胺（Formamide）中（如1 mL/100mg组织），60°C水浴孵育24小时，萃取染料。
      • 离心后取上清，用分光光度计在620nm波长处测定吸光度（OD值）。染料渗出量通过标准曲线计算，结果以微克染料/克组织表示。
    • 组织病理学检查：
      • 攻击后4-8小时（反应高峰），处死动物，取攻击部位皮肤及皮下组织。
      • 组织块经4%多聚甲醛固定24小时以上，常规脱水、石蜡包埋。
      • 切片（5μm厚度），进行H&E染色。
      • 光学显微镜下观察：重点评估血管炎（血管壁纤维素样坏死、炎症细胞浸润）、中性粒细胞大量浸润、出血、水肿、组织坏死程度。
 

四、结果

  1. 临床表现： OVA攻击组大鼠在攻击后2-6小时内，注射部位迅速出现明显的红斑和肿胀。严重者可在6-24小时内出现紫绀、出血点甚至中心坏死灶。PBS对照组无明显变化。
  2. 水肿定量： OVA攻击组足垫厚度或背部皮肤湿重/干重比值在攻击后4-6小时达到峰值，显著高于对照组（p<0.01）。
  3. 血管通透性： OVA攻击组皮肤组织伊文思蓝渗出量在攻击后1-4小时显著升高，峰值通常在2-4小时，明显高于对照组（p<0.001）。
  4. 组织病理学： H&E染色显示OVA攻击部位真皮及皮下组织弥漫性重度水肿，小血管（小静脉、毛细血管）扩张充血，大量中性粒细胞浸润聚集于血管壁及周围组织（白细胞碎裂性血管炎）。可见血管壁纤维素样坏死、红细胞外渗（出血）。严重病例可见表皮及真皮浅层坏死。PBS对照组仅见轻微或无炎症细胞浸润。
 

五、机制探讨

  1. 致敏阶段： 皮下注射OVA/CFA乳剂诱导机体产生高滴度的抗OVA IgG抗体（主要是IgG1, IgG2a/b）。
  2. 攻击阶段： 局部皮内注射大量可溶性OVA抗原。
  3. 免疫复合物形成与沉积： 注入的OVA抗原与血循环中弥散至局部的特异性IgG抗体结合，在注射部位的小血管壁形成可溶性抗原-抗体复合物（IC）。
  4. 补体激活： 沉积的IC通过经典途径激活补体系统，产生过敏毒素（C3a, C5a）和趋化因子（C5a）。
  5. 炎症细胞募集与活化： C5a等强力趋化因子招募大量中性粒细胞至IC沉积部位。中性粒细胞试图吞噬IC，释放溶酶体酶（蛋白酶、胶原酶、弹性蛋白酶）、活性氧自由基（ROS）及炎性细胞因子（如TNF-α, IL-1β）。
  6. 组织损伤： 释放的酶和ROS直接破坏血管基底膜及周围结缔组织，导致血管通透性急剧增加（水肿、染料渗出）、血管壁损伤（坏死、出血）及周围组织损伤（坏死）。临床表现为红肿热痛及功能障碍。
 

六、模型应用

  1. Ⅲ型超敏反应机制研究： 深入探讨IC沉积、补体激活、中性粒细胞募集活化及组织损伤的具体分子机制。
  2. 抗炎药物筛选与评价： 测试新型抗炎药、免疫抑制剂、生物制剂等对Arthus反应的干预效果，评价其对血管炎、水肿、中性粒细胞浸润等的抑制作用。
  3. 补体系统研究： 评估补体成分或抑制剂在Ⅲ型超敏反应中的作用。
  4. 药物安全性评价： 评估某些药物（如生物制剂）诱发Ⅲ型超敏反应的风险。
 

七、注意事项

  1. 动物福利与伦理： 实验方案必须经机构动物伦理委员会审查批准。操作过程遵循减少（Reduction）、优化（Refinement）、替代（Replacement）的“3R”原则。密切观察动物状态，出现严重反应（如大面积坏死、活动严重受限）应提前实施人道终点。
  2. 抗原攻击剂量与浓度： 需根据预实验结果优化，剂量过低反应弱，过高可能导致动物死亡或非特异性损伤。通常OVA剂量在0.25-2mg/只。
  3. 攻击部位选择： 足垫便于水肿测量，但操作需轻柔避免损伤；背部皮肤便于取材进行病理和渗出分析。
  4. 实验对照： 必须设立合适的对照组（PBS攻击或未致敏动物OVA攻击）。
  5. 时间点选择： 不同指标（临床表现、水肿、渗出、病理）的高峰时间不同，需根据研究目的确定取样时间。典型病理变化在攻击后4-8小时最显著。
  6. 操作规范： 注射、取材、称重、测量等操作需规范一致，避免人为误差。
  7. 人员防护： 处理CFA、麻醉剂、固定液等试剂时需做好个人防护（手套、口罩、防护眼镜）。
 

结论：
卵白蛋白联合弗氏完全佐剂致敏SD大鼠，并通过局部皮内注射OVA抗原成功诱导的急性Arthus反应模型，是研究Ⅲ型超敏反应发病机制、病理特征及筛选干预药物的经典、可靠且重现性良好的工具。该模型能清晰模拟由免疫复合物沉积介导的急性炎症过程，表现为特征性的血管炎、剧烈水肿、中性粒细胞浸润和组织损伤。严谨的实验设计和规范的操作是保证模型成功的关键。