雨蛙素+LPS诱导的小鼠胰腺炎

发布时间：2025-06-30 14:51:23 阅读量：1 作者：生物检测中心

雨蛙素联合LPS诱导小鼠急性胰腺炎模型的建立与应用

急性胰腺炎（AP）是一种临床常见的急腹症，其发病机制复杂，涉及腺泡细胞损伤、炎症反应过度激活及可能的全身并发症。建立稳定可靠的动物模型是深入研究其病理生理学机制和探索潜在治疗策略的基础。雨蛙素（Caerulein）联合脂多糖（LPS）诱导的小鼠模型因其操作相对简便、重复性好且能模拟人类胰腺炎的关键特征，已成为广泛应用的经典模型之一。

模型建立原理

  1. 雨蛙素的作用： 雨蛙素是胆囊收缩素（CCK）的类似物。当超生理剂量重复作用于小鼠时：

    • 过度刺激腺泡细胞： 持续激活腺泡细胞内的酶原分泌和合成通路，导致细胞内酶原颗粒异常积聚。
    • 扰乱胞内钙稳态： 引起细胞内钙离子浓度持续升高，破坏细胞器（尤其是酶原颗粒和溶酶体）的稳定性。
    • 诱导胞内胰酶提前活化： 溶酶体水解酶（如组织蛋白酶B）与酶原（如胰蛋白酶原）在胞内异常共定位，导致胰蛋白酶原在腺泡细胞内被过早激活为胰蛋白酶。
    • 启动腺泡细胞损伤： 活化的胰蛋白酶进一步激活其他消化酶原（如弹性蛋白酶原、磷脂酶A2原），引发腺泡细胞的自体消化、水肿、空泡变性和坏死。这是胰腺炎发生的初始事件。

  2. LPS的作用： LPS是革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分，是强效的微生物相关分子模式（MAMP）：

    • 激活固有免疫系统： LPS通过结合其模式识别受体TLR4（Toll-like receptor 4），主要在巨噬细胞、中性粒细胞等免疫细胞上表达，触发下游炎症信号通路（如NF-κB, MAPK）的强烈活化。
    • 放大炎症反应： 诱导大量促炎细胞因子（如TNF-α, IL-1β, IL-6）和趋化因子（如MCP-1)的产生与释放。
    • 模拟继发性炎症和系统性损伤： 在雨蛙素诱导的腺泡细胞损伤和局部炎症的基础上，LPS注射能系统地、显著地放大胰腺局部的炎症反应强度，并促进炎症向全身扩散，模拟临床上胰腺炎继发感染或系统性炎症反应综合征（SIRS）的状态，使模型更接近重症胰腺炎的部分特征。

  3. 协同效应： 雨蛙素主要靶向胰腺腺泡细胞，诱发胰腺局部损伤和炎症；LPS则全身性地激活免疫系统，产生强烈的促炎风暴。两者联合使用产生了显著的协同作用：

    • 雨蛙素造成的胰腺屏障破坏和局部炎症为LPS的系统性效应提供了作用靶点和放大环境。
    • LPS激发的全身炎症反应反过来加剧胰腺的缺血、氧化应激和免疫细胞浸润，导致更严重的腺泡坏死、胰腺水肿、出血甚至远处器官（如肺、肾）损伤。
    • 这种叠加效应使模型能更全面地模拟人类中重度胰腺炎的病理过程。
 

标准造模方法（以C57BL/6小鼠为例）

  1. 实验动物： 通常选用6-8周龄、体重18-22g的健康雄性C57BL/6小鼠。实验前适应性饲养一周，自由摄食饮水。
  2. 试剂准备：
    • 雨蛙素： 用无菌生理盐水或磷酸盐缓冲液（PBS）溶解，配制成适当浓度的工作液（通常约100 µg/kg/次的浓度）。计算好每次注射所需的体积（通常5-10 mL/kg体重）。
    • LPS： 用无菌无热原生理盐水溶解（常用来源如大肠杆菌O55:B5）。工作浓度根据实验设计（通常单次注射剂量在5-20 mg/kg体重）。
  3. 诱导过程：
    • 雨蛙素阶段： 小鼠腹腔内注射雨蛙素溶液（剂量通常为50-100 µg/kg体重/次）。关键点： 需要反复多次注射，间隔时间通常为每小时1次。总给药次数及持续时间是模型严重程度的关键调节因素：
      • 轻度模型： 通常注射6-7次（持续6-7小时）。
      • 中重度模型： 通常注射9-12次（持续9-12小时）。最后一次雨蛙素注射完成后，让动物短暂休息（约30分钟到1小时）。
    • LPS阶段： 在小鼠腹腔内或尾静脉注射LPS溶液（剂量范围通常在5-20 mg/kg体重）。腹腔注射更常用且操作简便。
  4. 对照组设置（至关重要）：
    • 假手术组/空白对照组： 注射与雨蛙素/LPS等体积的无菌生理盐水或PBS，注射时间和次数与模型组一致。
    • 雨蛙素单独组： 仅接受与模型组相同方案的雨蛙素反复注射，最后注射等体积生理盐水代替LPS。
    • LPS单独组： 仅接受单次LPS注射（通常与模型组LPS剂量相同），之前接受相应次数的生理盐水注射代替雨蛙素。
  5. 观察与取材： LPS注射后，根据研究目的在不同时间点（如12h, 24h, 48h, 72h）进行观察、取材：
    • 临床观察： 记录小鼠精神状态、活动度、竖毛、腹部外形（膨隆提示腹水）、呼吸状态、死亡率等。
    • 样本采集： 麻醉小鼠，采集血液（用于分离血清/血浆测生化指标和炎症因子），然后灌注生理盐水后迅速取出胰腺组织及其他目标器官（如肺、肝、肾、空肠）。胰腺组织一部分立即固定于中性福尔马林中用于石蜡包埋和HE染色等组织病理学检查；另一部分迅速冻存于液氮或-80°C冰箱，用于后续分子生物学检测（如Western Blot, PCR, 酶活性测定）。
 

模型评价指标

  1. 胰腺组织病理学评分（金标准）： HE染色切片，盲法由病理专业人员评估：

    • 水肿： 腺泡间隙增宽程度。
    • 炎症细胞浸润： 中性粒细胞等炎症细胞在胰腺间质和腺泡周围的浸润数量。
    • 腺泡细胞空泡变性： 胞浆内出现空泡的数量。
    • 腺泡坏死： 腺泡细胞核固缩、碎裂、溶解，细胞结构崩解的范围。
    • 出血： 胰腺组织内红细胞渗出的程度。
    • 通常采用半定量评分系统（如Schmidt或Spaeth评分系统）对上述各项进行评分并计算总分。

  2. 血清/血浆生化指标：

    • 胰腺损伤标志物： 淀粉酶（AMY）、脂肪酶（LIPA）活性显著升高是诊断AP的经典指标。
    • 炎症因子： TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-10等的水平显著升高，反映全身炎症反应强度。
    • 肝肾功能指标： 丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、尿素氮（BUN）、肌酐（CRE）等，评估胰腺炎导致的肝肾功能损伤。

  3. 胰腺组织内炎症因子水平： 通过ELISA、RT-PCR或Western Blot检测胰腺匀浆中TNF-α, IL-1β, COX-2, MPO（髓过氧化物酶，反映中性粒细胞浸润）等的表达或活性，反映胰腺局部的炎症状态。

  4. 胰腺组织内胰蛋白酶活性： 检测胰蛋白酶等消化酶在胰腺组织中的活化水平，直接反映模型的核心病理特征。

  5. 胰腺组织湿/干重比： 定量评估胰腺水肿程度。

  6. 其他器官损伤评估： 如肺组织湿/干重比评估肺水肿，肺、肾组织HE染色评估病理损伤等。

  7. 生存率分析： 对于模拟重症AP的研究，长期观察并记录死亡率是重要的评价终点。

 

模型特点与优势

  1. 操作相对简便，成本可控： 主要涉及腹腔/静脉注射，无需复杂手术。
  2. 诱导时间较短，可重复性强： 通常在一天内完成诱导，病理变化在12-72小时内显著且稳定。
  3. 能模拟AP核心病理过程： 成功再现了人类AP的腺泡细胞损伤、胰酶活化、胰腺水肿、炎症细胞浸润、局部及系统性炎症反应等关键特征。
  4. 严重程度可控： 通过调节雨蛙素的注射次数（时间）和LPS的剂量，可以较灵活地控制模型的严重程度（从轻度水肿型到中重度坏死型）。
  5. 适用于机制研究和药物筛选： 模型建立的路径明确（过度刺激+炎症放大），非常适合研究胰腺炎发生发展中的具体信号通路（如钙信号、NF-κB、NLRP3炎症小体、自噬、细胞死亡方式等）及评估潜在治疗药物的效果（抗炎、抗氧化、抑制酶原活化、调节细胞死亡等）。
  6. 可模拟部分并发症： LPS的加入增加了发展为多器官功能障碍综合征（MODS）的可能性，使其成为研究AP相关肺损伤、肾损伤等的常用工具。
 

应用范围

  1. 胰腺炎发病机制研究： 深入研究腺泡细胞损伤、胰酶活化、炎症级联反应、免疫细胞浸润、氧化应激、内质网应激、自噬、细胞焦亡/坏死性凋亡等在AP中的作用。
  2. 新型治疗策略评估： 测试潜在的治疗药物（如蛋白酶抑制剂、抗炎因子、抗氧化剂、特异性通路阻断剂、中药单体/复方）、干细胞治疗、基因治疗等在缓解胰腺损伤、抑制炎症反应、减轻器官衰竭方面的效果及作用机制。
  3. 重症急性胰腺炎（SAP）模型基础： 通过调整参数（如增加雨蛙素次数、提高LPS剂量），该模型可作为研究SAP及其并发症（如胰腺坏死、感染、ARDS、AKI）的基础。
  4. 感染与胰腺炎关系研究： 特别适合研究继发性感染（通过LPS模拟）对胰腺炎病程的恶化作用及干预措施。
  5. 胰腺损伤与再生研究： 在恢复期阶段，可用于研究损伤后胰腺组织的修复与再生机制。
 

注意事项

  1. 动物品系敏感性： C57BL/6是最常用品系，但不同品系或来源的小鼠对雨蛙素/LPS的敏感性可能存在差异，需预实验确定最佳剂量和方案。
  2. 剂量和方案优化： 文献报道的雨蛙素和LPS剂量范围较宽（雨蛙素：50-100 µg/kg/次； LPS：5-20 mg/kg）。具体剂量、注射次数、LPS注射时间点（最后一次雨蛙素后立即或间隔一段时间）需根据研究目标（模拟轻中重度）和实验室条件进行优化和标准化。LPS剂量过高可能导致急性休克死亡而非特异性胰腺损伤。
  3. LPS来源与活性： 不同来源和批次的LPS活性差异很大，需注明来源并尽量使用同一批次。
  4. 动物福利与伦理： 该模型会给动物带来痛苦（腹痛、不适）。必须严格遵守动物实验伦理规范，提供必要的镇痛支持（在实验方案允许且不影响主要观察指标的前提下），设定人性化的终止点，尽量减少动物痛苦。
  5. 标准化操作： 注射操作需熟练、准确，避免药物漏出或注入肠道。注射体积、时间间隔需严格遵守方案。
  6. 麻醉与取材： 取材时需深度麻醉，灌注要彻底以保证组织固定良好。组织处理需迅速，尤其是用于酶活性或分子生物学检测的样本。
  7. 对照组设置完善： 必须设立恰当的对照组（空白对照、单雨蛙素对照、单LPS对照），才能准确解读模型的表型和药物干预的效果，避免将LPS本身的系统性效应误认为是胰腺炎特有。
 

总结

雨蛙素联合LPS诱导的小鼠急性胰腺炎模型，通过超生理剂量雨蛙素反复刺激造成胰腺腺泡细胞损伤和胰酶异常活化，再辅以LPS系统性激发强烈的炎症反应，有效模拟了人类急性胰腺炎的核心病理生理过程。该模型具有操作相对便捷、诱导周期短、可重复性好、严重程度可控以及与人类疾病特征吻合度高等显著优势，使其成为研究AP发病机制和评估新型治疗策略不可或缺的有力工具。深入理解和熟练掌握该模型的原理、标准化操作流程、评价体系及其局限性，对于获得可靠、可重复的高质量研究数据至关重要。研究人员在使用该模型时，必须始终将动物福利放在首位，并严格遵守伦理规范。