LPS诱导小鼠败血症模型：机制与应用
摘要： 脂多糖（LPS）诱导的小鼠败血症模型是研究败血症发病机制、炎症反应及潜在治疗策略的核心实验工具。本模型通过模拟革兰氏阴性菌感染引发的全身炎症反应，为理解败血症的免疫紊乱、器官损伤及探索干预靶点提供了重要平台。本文详细阐述该模型的建立方法、病理生理机制、评估指标及应用价值。
一、引言
败血症是由宿主对感染的反应失调引发的危及生命的器官功能障碍，是重症监护病房死亡的主要原因之一。革兰氏阴性菌是败血症最常见的病原体，其细胞壁外膜的主要成分LPS（内毒素）是触发过度炎症反应的关键分子。LPS诱导的小鼠败血症模型因其操作相对简便、重复性好、能有效模拟人体败血症早期炎症风暴和器官损伤特征，而被广泛应用于基础与转化研究。
二、LPS与败血症的病理生理机制
- 识别与信号启动： LPS首先与血浆中的脂多糖结合蛋白结合，随后转运至免疫细胞（如巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞）表面的模式识别受体CD14。CD14将LPS呈递给TLR4（Toll样受体4）-MD2复合物。
- 信号级联放大： TLR4活化后，通过髓样分化因子88（MyD88）依赖途径和TRIF依赖途径启动下游信号传导。MyD88途径主要导致NF-κB和MAPK激酶的活化；TRIF途径则激活IRF3。
- 炎症因子风暴： 上述信号通路最终导致大量促炎因子（如TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12）、趋化因子（如MCP-1、KC、MIP-1α）以及一氧化氮（NO）的爆发性释放，形成“细胞因子风暴”。
- 免疫与代谢紊乱： 过度的炎症反应导致血管内皮损伤、毛细血管渗漏、微循环障碍、组织灌注不足。同时，免疫细胞功能耗竭，出现免疫抑制状态。线粒体功能障碍和代谢重编程（如糖酵解增强）加剧组织损伤。
- 多器官功能障碍： 炎症、缺氧、代谢紊乱等因素共同作用，损害肺（急性肺损伤/ARDS）、肾（急性肾损伤）、肝、心、肠等器官功能，最终导致多器官功能衰竭（MODS）。
三、LPS诱导小鼠败血症模型的建立
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实验动物：
- 常用品系：C57BL/6、BALB/c等成年（8-12周龄）小鼠。不同品系对LPS敏感性存在差异（如C3H/HeJ小鼠因TLR4突变对LPS耐受）。
- 饲养：标准条件下饲养（温度22±2°C，湿度50±10%，12/12小时光暗循环），自由摄食饮水。
- 伦理：所有操作须遵循实验动物福利与伦理委员会的规定。
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LPS准备：
- 来源：通常使用大肠杆菌（如O111:B4, O55:B5, O127:B8）提取的高纯度LPS。
- 溶解：用无菌无热原生理盐水或磷酸盐缓冲液（PBS）溶解LPS。可先配制成高浓度母液（如1-5 mg/mL），分装冻存于-20°C或-80°C。
- 稀释：实验当天，用无菌无热原生理盐水或PBS将母液稀释至所需工作浓度。所有操作需在无菌、无热原环境下进行（如超净台），使用无热原枪头、离心管等耗材。
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给药途径与剂量：
- 腹腔注射： 最常用途径。操作简便，能快速引发全身性反应。注射体积通常为5-10 mL/kg体重（如20g小鼠注射100-200 μL）。
- 静脉注射： 通过尾静脉注射。起效更快，炎症反应更剧烈，对操作技术要求较高。注射体积通常为5 mL/kg体重。
- 剂量选择： 剂量范围很广（5-40 mg/kg），取决于研究目的：
- 致死模型： 用于研究死亡机制或评估药物对生存率的影响。需通过预实验确定特定品系、性别、周龄小鼠的LD50或LD80剂量（如15-30 mg/kg腹腔注射）。
- 亚致死模型： 用于研究炎症反应、器官损伤机制或药物抗炎/器官保护作用（如5-15 mg/kg腹腔注射）。此时动物通常不会死亡或死亡率较低，可在特定时间点采集样本分析。
- 关键： 剂量是模型成败的核心！必须严格参考文献并结合实验室具体条件（品系、环境等）通过预实验精确确定。
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对照组设置：
- 空白对照组： 注射等体积无菌无热原生理盐水或PBS。
- 假手术组（若涉及操作）： 仅进行注射操作而不注射LPS。
- 药物干预组： 若研究药物治疗效果，需设置相应的溶媒对照组（注射药物所用溶剂）和药物干预组。
四、模型评估指标
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临床观察与生存分析：
- 行为学：观察小鼠活动度（减少）、竖毛、弓背、嗜睡、颤抖、呼吸困难、眼分泌物等。
- 生理状态：监测体温（常出现体温先升高后降低）、体重减轻。
- 生存率：在致死模型中，定时记录动物死亡时间，绘制Kaplan-Meier生存曲线。
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血液学与生化指标：
- 血浆/血清炎症因子： ELISA检测TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10等关键促炎和抗炎因子的水平（常在LPS注射后1-6小时达高峰）。
- 器官功能标志物：
- 肝：谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、总胆红素（TBIL）。
- 肾：血肌酐（SCr）、血尿素氮（BUN）。
- 心肌：肌酸激酶同工酶（CK-MB）、肌钙蛋白I（cTnI）。
- 血常规： 白细胞总数及分类计数（早期可升高，后期可降低或出现核左移）、血小板计数（常下降）。
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组织病理学检查：
- 取材：在预定时间点（如6、12、24、48小时）安乐死小鼠，取肺、肝、肾、小肠等器官。
- 固定：多聚甲醛固定。
- 切片与染色：石蜡包埋、切片、HE染色。
- 评估：显微镜下观察组织损伤程度：
- 肺：炎性细胞浸润、肺泡间隔增厚、出血、水肿、透明膜形成。
- 肝：肝细胞变性坏死、炎性浸润、窦状隙充血。
- 肾：肾小管上皮细胞变性坏死、管型形成、间质炎性浸润。
- 小肠：绒毛结构破坏、上皮细胞脱落、炎性浸润。
- 半定量评分：常采用标准化的组织学损伤评分系统。
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其他指标（根据研究目的）：
- 氧化应激：检测组织或血清中丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）等。
- 细胞凋亡：TUNEL染色检测组织凋亡细胞；Western Blot检测凋亡相关蛋白（如Caspase-3, Bcl-2/Bax）。
- 免疫细胞分型：流式细胞术分析脾脏、外周血中免疫细胞（如巨噬细胞、T细胞亚群、MDSCs）的比例和活化状态。
- 凝血功能：凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）、纤维蛋白原（FIB）、D-二聚体等。
- 细菌易位：检测肠系膜淋巴结、肝脏、脾脏或血液中的细菌负荷（在非致死模型中，LPS本身不是活菌，此指标主要用于评估肠道屏障功能破坏）。
五、模型特点与局限性
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优点：
- 操作相对简单、成本较低、重复性好。
- 能有效模拟革兰氏阴性菌败血症早期强烈的炎症反应（细胞因子风暴）。
- 可重现败血症相关的多器官损伤病理改变。
- 适用于高通量筛选抗炎药物或器官保护药物。
- 便于研究特定信号通路（如TLR4）在败血症中的作用（通过基因敲除鼠或拮抗剂）。
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局限性：
- 非感染性： LPS本身不是活菌，缺乏感染过程中病原体的持续、播散及适应性免疫反应的动态演变。不能模拟败血症后期的免疫抑制状态。
- 单一触发因素： 仅模拟了内毒素这一单一触发因素，而临床败血症常由多种病原体和毒素共同作用。
- 时间窗短： 主要模拟急性期（数小时至48小时），难以研究慢性过程或长期后遗症。
- 种属差异： 小鼠与人类在免疫系统、代谢等方面存在差异，研究结果外推至临床需谨慎。
- 剂量依赖性： 结果高度依赖于LPS剂量和品系，标准化需严格。
六、应用
LPS诱导的小鼠败血症模型主要用于：
- 阐明内毒素血症和败血症早期炎症反应（如TLR4信号通路、细胞因子风暴）的分子机制。
- 研究败血症相关器官损伤（如ALI/ARDS、AKI、肝损伤、肠屏障功能障碍）的发生机制。
- 筛选和评估潜在的治疗药物或干预措施（如中和抗体、小分子抑制剂、细胞疗法）的抗炎、抗氧化、器官保护和提高生存率的效果。
- 研究特定基因在败血症中的作用（利用转基因或基因敲除小鼠）。
- 探索败血症相关的免疫代谢改变。
七、替代与补充模型
为克服LPS模型的局限性，常结合或选用其他模型：
- 细菌感染模型：
- 腹腔注射活菌： 如盲肠结扎穿孔术（CLP，被视为“金标准”模型，模拟多微生物感染）、腹腔注射特定菌株（如大肠杆菌、铜绿假单胞菌）。能更全面地模拟感染过程（包括免疫抑制期）。
- 肺炎模型： 气管内滴注细菌（如肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌）模拟肺部感染诱发的败血症。
- 内毒素+继发感染模型： 先给予亚致死剂量LPS诱导炎症和免疫抑制状态，再给予低剂量活菌进行二次打击，模拟临床常见的继发感染。
八、结论
LPS诱导的小鼠败血症模型是研究革兰氏阴性菌败血症早期炎症反应和器官损伤机制的重要工具。其操作简便、可控性强，在基础机制研究和药物筛选方面具有独特价值。然而，研究者必须充分认识其作为“内毒素休克”模型的局限性（非感染性、单一因素、时间窗短）。在设计实验时，应根据具体的研究目的，审慎选择模型（单独使用LPS模型，或结合CLP等细菌感染模型），并严格优化实验条件（尤其是LPS剂量），才能获得可靠、可重复的结果，为深入理解败血症病理生理和开发新的治疗策略提供坚实的实验基础。
注意事项：
- 无热原操作： 整个实验流程（LPS溶解稀释、注射器、耗材）必须严格遵守无热原操作规范，避免外源性内毒素污染干扰结果。
- 动物福利： 密切观察动物状态，尤其在高剂量致死模型中，对出现严重痛苦的动物应及时实施人道终点安乐死。
- 实验重复： 为保障结果的可靠性，实验需有足够的重复次数和动物数量。
- 数据解读： 结合多种指标进行综合评估，避免单一指标的片面性。理解模型局限性，谨慎外推结论。