抗生素诱导小鼠腹泻

抗生素诱导小鼠腹泻模型建立方法

抗生素相关性腹泻（AAD）是临床常见药物不良反应，严重影响患者健康及治疗依从性。建立稳定可靠的动物模型是深入研究其发病机制及开发防治策略的关键基础。本实验方案详细描述了利用广谱抗生素成功诱导小鼠腹泻模型的标准化流程。

一、核心机制
广谱抗生素（如氨苄青霉素、克林霉素等）通过非选择性杀灭肠道共生菌群，导致微生物群落结构严重失衡（菌群失调）。其后果包括：

1. 保护屏障破坏： 共生菌形成的物理及化学屏障减弱。
2. 代谢功能丧失： 短链脂肪酸（如丁酸）等重要代谢产物合成减少，影响肠上皮能量供应和完整性。
3. 病原体定植抗力下降： 条件致病菌（如艰难梭菌）易于过度增殖并产生毒素。
4. 胆汁酸代谢紊乱： 次级胆汁酸积累刺激肠液分泌。
   这些因素共同削弱肠道屏障功能、改变渗透压平衡、刺激肠液分泌，最终引发腹泻症状。

二、实验材料准备

1. 实验动物： 成年SPF级C57BL/6小鼠（或根据研究需求选择其他品系），雌雄各半或按实验设计分组，平均体重18-25g。饲养于恒温（22±2℃）、恒湿（50±10%）、12小时明暗循环的标准动物房中，自由摄食饮水。实验前适应性饲养至少一周。
2. 关键试剂：
   • 广谱抗生素： 选用氨苄青霉素（Ampicillin）或其与舒巴坦复合制剂、克林霉素（Clindamycin）、头孢曲松（Ceftriaxone）等（溶于无菌水）。
   • 无菌饮用水： 供配制抗生素溶液及对照组饮用。
   • 溶剂对照： 仅含抗生素溶剂（如无菌水或生理盐水）的溶液。
   • 生理盐水： 用于灌胃操作（如适用）。
   • 0.9% NaCl： 配制灌胃液（如适用）。
   • 组织固定液： 如4%多聚甲醛。
   • 微生物样品保存液： 如DNA/RNA Shield或其他专用保存液。
3. 主要器材： 体重秤、灌胃针（适用于灌胃给药）、配有饮用水瓶的动物笼具、计时器、粪便收集管、一次性手套、口罩、解剖器械、组织切片相关设备、-80℃冰箱、微生物实验相关设备（如需后续检测）。

三、实验操作步骤

1. 实验动物分组与标记： 将小鼠随机分为模型组（抗生素处理组）和对照组（溶剂处理组），确保组间初始体重无显著差异。采用恰当方法（如耳标、尾部标记）进行个体标记。
2. 抗生素溶液配制（以氨苄青霉素灌胃为例）：
   • 称取适量氨苄青霉素粉末。
   • 用0.9%无菌生理盐水溶解，配制目标浓度的新鲜溶液（常用浓度范围：100 - 500 mg/kg体重/天，例如100mg/mL储备液）。溶液需新鲜配制或分装后于4℃避光保存不超过24小时。
3. 抗生素给药：
   • 方法一：自由饮水法（推荐用于饮水依赖性抗生素）：
     • 将计算好的抗生素粉末溶解于动物日常饮用水瓶中（浓度通常为1g/L）。
     • 模型组提供含抗生素的饮用水，对照组提供等体积的普通无菌饮用水。
     • 每日记录饮水量，根据平均饮水量和浓度计算实际摄入剂量，必要时调整浓度。
     • 每日更换新鲜配制的含抗生素水及对照水。
   • 方法二：灌胃法（适用于精确剂量控制）：
     • 根据小鼠体重计算每日所需灌胃体积（通常按10mL/kg体重计算）。
     • 每日固定时间（如上午9-11点），使用灌胃针对模型组小鼠进行抗生素溶液灌胃（如100mg/mL氨苄青霉素溶液，剂量100mg/kg，则灌胃体积为1 μL/g体重）。
     • 对照组小鼠在同一时间灌胃等体积的生理盐水。
     • 操作需温和熟练，避免损伤食道。
   • 给药周期： 通常连续给药5-7天。具体天数需根据预实验观察到的腹泻发生时间和稳定性确定。
4. 日常监测与记录：
   • 体重： 每日固定时间称量并记录各组所有小鼠体重。
   • 精神状态与毛发： 观察记录活动性、反应性、毛发光泽度等一般状态。
   • 摄食量与饮水量： 每日记录各组剩余饲料重量和饮水瓶剩余水量（或灌胃体积），计算消耗量。
   • 粪便性状评分（核心指标）： 每日定时观察笼具内垫料上粪便，根据设定的评分标准进行评分记录（见下表）。至少连续评分至停药后一定天数（如3-5天）以观察恢复情况。
   • 腹泻发生率： 计算每日各组中出现腹泻（评分≥2分）的小鼠比例。

粪便性状评分标准示例：

5. 终点样本采集（根据实验设计选择）：
   • 粪便样品： 在特定时间点（如给药结束当天、停药后第1、3、5天等）无菌收集新鲜粪便颗粒，迅速置于冻存管存于-80℃，用于后续肠道菌群分析（如16S rRNA测序、宏基因组测序）。
   • 血液采集： 如需血清学指标（如炎症因子），麻醉后通过眼眶后静脉丛或心脏穿刺采血，静置分离血清，-80℃保存。
   • 组织采集：
     • 麻醉后颈椎脱臼法安乐死小鼠。
     • 无菌操作快速取出所需肠段（通常取结肠中段或末端回肠/结肠交界处），置于预冷的生理盐水中轻轻漂洗。
     • 组织病理： 截取约1cm肠段，沿纵轴剖开，小心展平（可用大头针固定于软木板上），立即浸入足量4%多聚甲醛固定液中（>24小时），用于石蜡包埋、切片、HE染色观察肠黏膜结构（绒毛高度、隐窝深度、炎症浸润等）。
     • 分子生物学/生化： 截取所需肠段，迅速用预冷生理盐水冲洗内容物，吸干后液氮速冻，转移至-80℃保存，用于后续RNA/DNA提取、蛋白提取、酶活性测定等。
     • 肠道通透性评估（可选）： 可在处死前一定时间（如4小时）灌胃给予异硫氰酸荧光素-右旋糖酐（FITC-dextran），处死后取血检测血清荧光强度。
6. 恢复期观察（可选）： 停止抗生素暴露后，继续监测体重、粪便性状数天，评估肠道功能的自然恢复情况。

四、模型成功判定标准

1. 核心指标： 模型组小鼠在抗生素给药中后期（通常3-5天后）出现显著的粪便性状评分升高（平均分≥2分），且显著高于溶剂对照组（p<0.05）。
2. 腹泻发生率： 模型组腹泻发生率（粪便评分≥2分的个体所占比例）显著高于对照组。
3. 体重变化： 模型组小鼠体重增长停滞或出现下降趋势，显著低于对照组。
4. 组织学证据（确诊）： 模型组小鼠结肠或小肠组织切片HE染色显示不同程度病理改变：肠绒毛萎缩、隐窝结构紊乱、杯状细胞数量减少、固有层炎症细胞（如中性粒细胞、淋巴细胞）浸润增加。
5. 肠道菌群失调（重要佐证）： 模型组粪便菌群多样性（如Shannon指数）显著降低，特征性菌群组成改变（如厚壁菌门/拟杆菌门比值下降、潜在致病菌丰度升高）。

五、注意事项与伦理要求

1. 动物福利： 严格遵守实验动物伦理准则。
   • 实验方案必须获得所在机构动物实验伦理委员会（IACUC）的审查和批准。
   • 密切观察动物状态，若小鼠出现严重腹泻（水样便、肛门污秽）、体重急剧下降（超过初始体重20%）、明显脱水（皮肤弹性差）、精神沉郁等严重痛苦表现，应立即按照批准的处置方案进行干预（如补水、提前安乐死），不得让其承受不必要的痛苦。
2. 实验操作： 所有操作需在洁净环境下进行，严格无菌操作规范，尤其在灌胃、组织取样过程中，避免引入外源性污染。佩戴手套、口罩，勤更换垫料保持笼内清洁干燥，减少环境因素干扰。
3. 抗生素选择与剂量： 不同抗生素及剂量诱导效果存在差异。应根据预实验筛选确定能稳定诱导腹泻且动物可耐受的抗生素种类和浓度/剂量。避免使用毒性过大的抗生素。
4. 溶剂对照： 对照组必须严格使用不含抗生素的溶剂（如水或生理盐水），以排除溶剂本身或操作（如灌胃应激）对结果的影响。
5. 个体差异： 即使同品系小鼠对相同抗生素处理也可能存在个体反应差异。保证足够的样本量（通常每组n≥6-8）是获得可靠统计学结果的前提。
6. 样本处理： 用于微生物组分析的粪便样本必须迅速低温冷冻保存，避免反复冻融。用于组织病理的肠道标本需及时充分固定。

结论：
本方案通过标准化给药流程（自由饮水或灌胃）和细致的表型监测（粪便评分、体重等），结合终点组织病理学验证，可稳定建立抗生素诱导的小鼠腹泻模型。该模型能有效模拟临床AAD的核心特征—肠道菌群严重失调及随之而来的黏膜损伤和功能障碍。严格遵守动物伦理规范是模型成功建立和应用的基础。此模型为深入研究AAD病理生理机制、评估益生菌/益生元/粪菌移植等干预措施的有效性及相关药物开发提供了重要的实验平台。