DNBS/TNBS诱导的大小鼠肠炎(Crohn's disease)

发布时间：2025-06-30 14:29:08 阅读量：1 作者：生物检测中心

DNBS/TNBS诱导的大鼠肠炎模型：模拟克罗恩病病理的经典工具

背景与意义

炎症性肠病（IBD），尤其是克罗恩病（CD），是一种病因复杂的慢性肠道炎症性疾病，其特征为透壁性炎症、间歇性发作以及病变呈跳跃式分布。研究其发病机制和探索新的治疗策略高度依赖于能够模拟人类疾病关键特征的动物模型。在众多模型中，2,4-二硝基苯磺酸（DNBS）或2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS）诱导的大鼠（偶见小鼠）结肠炎模型，因其在免疫学和组织病理学上与人类CD的高度相似性，成为广泛应用和研究最为深入的工具之一。

模型构建原理

DNBS和TNBS本身是半抗原（小分子）。模型的构建关键在于将TNBS（或DNBS，两者机制相似，常统称为TNBS模型）溶解于一定浓度的乙醇溶液中：

  1. 黏膜屏障破坏： 高浓度乙醇（通常30-50%）作为载体，首先破坏结肠粘膜的物理屏障功能和通透性。
  2. 半抗原呈现： 失去屏障保护后，TNBS得以穿透粘膜层，与肠道内的自身蛋白质（或肽类）共价结合，形成完整的抗原（半抗原-载体复合物）。
  3. 免疫应答激活： 这些新形成的“自身”抗原被肠道粘膜下的抗原呈递细胞（如树突状细胞）识别、摄取和处理。
  4. Th1/Th17型炎症反应： 处理后的抗原被呈递给初始T细胞，在肠道微环境（如存在微生物相关分子模式MAMPs）的作用下，强烈偏向于诱导Th1和Th17型免疫应答。这导致大量促炎细胞因子（如TNF-α, IFN-γ, IL-12, IL-17, IL-23）的产生和释放。
  5. 炎症级联放大与组织损伤： 这些细胞因子招募和激活更多的免疫细胞（中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞），释放活性氧自由基（ROS）、蛋白酶（如基质金属蛋白酶MMPs）等效应分子，最终导致肠黏膜上皮损伤、隐窝结构破坏、溃疡形成、水肿以及最终的透壁性炎症。慢性期可观察到肉芽肿样结构形成（虽然不如人类CD典型）。
 

建模方法（以大鼠为例）

  1. 动物准备：

    • 常用品系：Sprague Dawley (SD) 或 Wistar大鼠（对TNBS敏感性较高）。
    • 小鼠也可用，但模型稳定性通常不如大鼠。
    • 动物通常在特异性无病原体（SPF）级动物房饲养，实验前适应环境至少一周。
    • 建模前禁食（不禁水）一定时间（如12-24小时）以减少肠道内容物。

  2. 试剂配制：

    • TNBS/DNBS溶液： 将TNBS或DNBS粉末溶解于适当浓度的乙醇溶液中（常用浓度范围：30%-50% v/v）。TNBS的剂量通常在100-200 mg/kg体重（小鼠剂量较低，需优化）。
    • 对照溶液： 仅含相同浓度乙醇的生理盐水（体积匹配）。

  3. 诱导操作：

    • 麻醉： 大鼠通常使用吸入麻醉剂（如异氟烷）或注射麻醉剂（如氯胺酮/赛拉嗪混合液）进行轻度麻醉。
    • 给药：
      • 轻柔地将一根细软的导管（如聚乙烯管）经肛门插入大鼠直肠内。插入深度通常为6-8 cm（大鼠），确保溶液到达降结肠和横结肠区域（主要病变部位）。小鼠插入深度相应缩短（3-4 cm）。
      • 缓慢注入预定体积的TNBS/乙醇溶液（大鼠常用0.25-0.8 mL）。关键点： 注入后，需轻柔捏住大鼠肛门并短暂抬高后肢（大鼠保持头低位片刻，小鼠操作类似），以防止溶液立即排出，确保溶液与肠粘膜充分接触（约30秒至1分钟）。

  4. 术后护理：

    • 动物苏醒后放回笼中。
    • 提供充足饮水和易消化饲料。
    • 人道终点与疼痛管理： 密切观察动物状态（活动度、毛发、体重、便血等）。根据伦理要求和动物痛苦程度，给予必要的镇痛药物（如布托啡诺、美洛昔康等）。

  5. 疾病进程与评估：

    • 急性期： 通常在给药后1-3天炎症达到高峰。表现为体重显著下降、稀便、肉眼或隐血便、活动减少、拱背等。此期以强烈的急性炎症、中性粒细胞浸润、粘膜溃疡和水肿为特征。
    • 慢性期/恢复期： 7-14天后，炎症可能进入慢性阶段或开始恢复。慢性炎症特征包括淋巴细胞和巨噬细胞浸润、粘膜结构紊乱（隐窝变形、分支）、杯状细胞减少、纤维化和可能的肉芽肿样结构形成。但自发慢性化程度不如某些遗传模型稳定。
 

评估指标

  1. 临床指标：

    • 体重变化： 最常用、最敏感的指标之一，通常以初始体重的百分比表示。
    • 疾病活动指数(DAI)： 综合评分，常包含体重下降百分比、粪便性状（硬度、含水量）、便血程度等。
    • 腹泻/稀便发生率。
    • 活动度、毛发状态。

  2. 大体形态学评分：

    • 处死动物后，取出结肠并纵向剖开，用生理盐水轻柔冲洗。
    • 肉眼观察并评分：评估结肠缩短程度（长度变化）、充血、水肿增厚程度、溃疡（数量、大小、深度）、粘连、组织脆性等。

  3. 组织病理学评分（金标准）：

    • 取代表性结肠段（通常是远端到中段结肠），固定（如福尔马林）、脱水、包埋、切片、染色（常用苏木精-伊红H&E）。
    • 显微镜下盲法评分：评估炎症细胞浸润深度（粘膜层、粘膜下层、肌层、浆膜层）、炎症细胞密度、隐窝结构损伤/丢失（包括隐窝脓肿）、杯状细胞耗竭程度、粘膜/肠壁增厚、溃疡深度、肉芽肿形成等。评分系统多样，但都旨在量化上述病变的严重程度。

  4. 分子生物学与免疫学指标：

    • 细胞因子检测： 通过ELISA、qPCR、流式细胞术或多重免疫分析法检测结肠组织匀浆液、血清或培养上清中的促炎因子（TNF-α, IFN-γ, IL-1β, IL-6, IL-12, IL-17, IL-23）和抗炎因子（IL-10, TGF-β）水平。
    • 髓过氧化物酶(MPO)活性： 定量测定结肠组织中的MPO活性，作为中性粒细胞浸润的标志物。
    • 免疫组织化学/免疫荧光： 定位特定细胞类型（如巨噬细胞、T细胞亚群）或蛋白表达（如紧密连接蛋白）在组织中的分布与表达量。
    • 肠道屏障功能检测： 如FITC-葡聚糖通透性实验、电生理学（Ussing chamber）测定跨上皮电阻（TEER）。
    • 微生物组分析： 研究肠道菌群组成变化及其与炎症的关系。
 

模型优势

  1. 免疫机制相似性高： 能很好地模拟人类CD的Th1/Th17型免疫反应特征。
  2. 病理特征显著： 可诱导出透壁性炎症、粘膜溃疡、水肿、隐窝破坏、浸润细胞类型符合CD特征，有时可见肉芽肿样结构。
  3. 建模快速直观： 操作相对简单，成本较低，疾病表型（体重下降、组织损伤）在短期内（数天）即可出现且易于观察和量化。
  4. 干预研究平台： 是评估潜在治疗药物（如抗TNF-α抗体、免疫抑制剂、新型生物制剂、小分子抑制剂、益生菌、天然产物等）疗效和作用机制的常用平台。可在诱导前（预防）或诱导后（治疗）给药进行评估。
  5. 机制研究工具： 广泛应用于研究肠道炎症的启动机制、免疫细胞激活与迁移、细胞因子网络、氧化应激、肠屏障功能障碍、菌群-宿主互作等关键生物学过程。
 

模型局限性

  1. 急性模型为主： 自发形成的慢性、复发性炎症不如某些遗传模型（如IL-10敲除）或长期DSS模型稳定，通常需要重复给药或改良方案来维持慢性炎症状态。
  2. 诱导剂毒性： TNBS本身具有细胞毒性，其诱导的损伤包含直接的化学损伤成分。乙醇作为载体也是重要的损伤因子。这与人CD的起始病因不同。
  3. 个体差异： 动物对TNBS的敏感性存在一定个体差异，可能导致组内变异较大。操作技术（如插管深度、溶液滞留时间）也会影响结果一致性。需要严格的操作规范和经验积累。
  4. 肉芽肿不典型： 虽然有时可见，但其形态和组织学特征通常不如人类CD的肉芽肿典型。
  5. 菌群依赖性： 模型的诱导和严重程度受动物肠道菌群状态影响。抗生素处理或无菌动物可能减弱模型表型。
 

应用与结论

TNBS/DNBS诱导的大鼠肠炎模型是研究克罗恩病发病机制和筛选评估潜在治疗方法的不可或缺且高度可靠的实验工具。其核心价值在于成功模拟了CD的关键免疫学特征（Th1/Th17主导）和典型的透壁性病理损伤。尽管存在局限性（如急性模型的倾向性和诱导剂毒性），但其构建相对便捷、表型明显且与人类疾病核心免疫通路高度相关的优点使其在基础研究和药物研发中持续发挥着重要作用。研究者通常根据具体科学问题，结合其他模型（如DSS模型、基因工程模型、过继转移模型等）或改良TNBS建模方案（如多次低剂量给药）来更全面地探究IBD的复杂病理生理过程和干预策略。该模型极大地增进了我们对克罗恩病相关免疫失调和组织损伤机制的理解，并为开发更有效的临床治疗方案提供了重要平台。

参考文献 (示例)

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