特定肽段诱导大小鼠实验性自身免疫性葡萄膜炎模型研究进展
实验性自身免疫性葡萄膜炎（Experimental Autoimmune Uveitis, EAU）是研究人类葡萄膜炎（如VKH综合征、Behcet病相关葡萄膜炎、特发性葡萄膜炎等）发病机制和治疗策略的关键动物模型。其中，利用特定免疫原性肽段诱导的EAU模型因其靶向性强、可重复性高，已成为该领域研究的核心技术手段。
一、 模型原理与意义
EAU的核心在于打破机体对视网膜自身抗原的免疫耐受，模拟人类葡萄膜炎的自身免疫攻击过程。研究者从关键的视网膜抗原中筛选并鉴定出具有强免疫原性的短肽片段（通常为15-20个氨基酸），这些肽段能高效激活特异性T细胞（主要是Th1和Th17亚群），引发针对视网膜组织的炎症级联反应。相较于使用全蛋白抗原（如光感受器间维生素A类结合蛋白IRBP、S抗原S-Ag、恢复蛋白Recoverin等），肽段诱导模型具有以下显著优势：
- 靶点精确： 可聚焦于特定抗原表位，精确研究其免疫致病机制。
- 免疫原性强： 精心筛选的肽段常具有更强的T细胞刺激能力，诱导成功率更高。
- 批次稳定性好： 人工合成肽段纯度高、结构明确，避免了天然蛋白提取物的批次差异。
- 便于机制研究： 易于进行结构修饰（如突变、截短）以研究表位功能。
- 物种适用性广： 可根据目标动物（小鼠、大鼠）选择对应物种的同源肽段或人源肽段（需验证免疫原性）。
二、 常用诱导肽段
多种视网膜抗原的肽段被成功用于诱导大小鼠EAU，以下为经典且常用的代表（注意：具体序列请查阅文献，此处仅列出常见靶点）：
- IRBP衍生肽段：
- 人/鼠IRBP R16 (hIRBP1-20 / mIRBP1-20)： 人源IRBP N端第1-20位氨基酸肽段及其鼠源同源肽段，是诱导小鼠（如C57BL/6, B10.RIII）EAU最常用的强效肽段之一。
- 人IRBP R14 (hIRBP651-670)： 另一高效人源IRBP肽段，常用于大鼠（如Lewis大鼠）EAU诱导。IRBP161-180、IRBP1177-1191等也是常用表位。
- S-Antigen (S-Ag) 衍生肽段： S-Ag的多个肽段（如S-Ag 342-355, S-Ag 286-306等）在历史上被广泛研究，可有效诱导大鼠（如Lewis大鼠）EAU。
- 其他抗原肽段： 如恢复蛋白(Recoverin)、视紫红质(Rhodopsin)等也鉴定出具有致病潜能的肽段。
三、 模型建立流程（以IRBP肽段诱导小鼠EAU为例）
- 实验动物： 选择易感品系小鼠（如C57BL/6, B10.RIII等）或大鼠（如Lewis大鼠），通常使用6-12周龄雌性或雄性。
- 肽段与佐剂乳化：
- 将合成的特定IRBP肽段（如R16）溶解于合适的缓冲液（如PBS）。
- 将肽段溶液与完全弗氏佐剂（CFA）按一定比例（通常为1:1体积比）混合。
- 使用连接器或注射器反复推拉，直至形成稳定的油包水乳剂（滴入水中不扩散）。
- 免疫接种：
- 通常采用皮下注射（s.c.），部位可选择背部、颈肩部、足垫等。足垫注射可增强局部引流淋巴结反应，但需注意动物福利。
- 常用剂量：小鼠约100-200 μg肽段/只（溶于100-200 μL乳剂中）；大鼠剂量相应增加。
- 常在免疫当天或稍后（如免疫后第0天或第7天），腹腔注射（i.p.）一定剂量的百日咳毒素（PTX），作为重要的免疫增强剂，能促进炎症细胞迁移和血-视网膜屏障破坏。
- 疾病进程观察：
- 潜伏期： 免疫后约7-14天（因品系、肽段、剂量而异）。
- 发病期： 通常在免疫后10-21天达到疾病高峰。
- 缓解期： 部分模型（如Lewis大鼠）具有自限性，可在数周后自发缓解；而小鼠模型（如C57BL/6）炎症可能持续更久。
四、 模型评价指标
- 临床评分： 定期进行裂隙灯生物显微镜检查，观察眼前段炎症（房水闪辉、细胞、纤维素性渗出、虹膜粘连等）和/或间接检眼镜检查观察眼后段炎症（玻璃体混浊、视网膜血管炎、视盘水肿、视网膜脉络膜浸润灶、视网膜下渗出等），根据炎症严重程度进行标准化临床评分。
- 组织病理学检查（金标准）： 动物处死后摘取眼球，固定、脱水、包埋、切片（通常矢状位切片）、染色（常用H&E染色）。在显微镜下评估：
- 炎症细胞（淋巴细胞、巨噬细胞、中性粒细胞等）浸润部位（睫状体平坦部、脉络膜、视网膜、玻璃体腔、视神经）和程度。
- 组织破坏情况：视网膜结构紊乱（光感受器层破坏、外核层细胞减少）、视网膜脱离、肉芽肿形成、视神经炎等。
- 采用标准化的组织病理学评分系统对炎症严重程度进行量化。
- 无创影像学检查（可选）：
- 光学相干断层扫描（OCT）： 活体评估视网膜各层结构变化（如视网膜厚度增加、层间积液、光感受器层损伤）。
- 眼底荧光素血管造影（FFA） / 吲哚菁绿血管造影（ICGA）： 评估血-视网膜屏障破坏（荧光素渗漏）、血管炎、脉络膜灌注异常等。
- 视网膜电图（ERG）： 评估视网膜功能损伤（如a波、b波振幅下降）。
- 免疫学指标检测：
- 流式细胞术： 分析脾脏、淋巴结或眼内浸润淋巴细胞亚群（如Th1, Th17, Treg等）比例及活化状态。
- 细胞因子检测： ELISA或CBA法检测血清、房水或体外刺激后淋巴细胞培养上清中的炎性因子（IFN-γ, IL-17, TNF-α）和抗炎因子（IL-10, TGF-β）水平。
- 抗原特异性T细胞增殖反应： 体外用相应肽段刺激淋巴细胞，检测增殖能力（如CFSE稀释法、³H-TdR掺入法）。
- 抗体检测： ELISA检测血清中抗相应肽段或视网膜抗原的自身抗体水平。
五、 应用价值
特定肽段诱导的EAU模型在以下研究中发挥核心作用：
- 发病机制研究： 深入解析特定抗原表位激活T细胞、触发炎症级联反应、招募免疫细胞浸润、破坏视网膜组织的分子与细胞机制。研究Th1/Th17细胞、调节性T细胞（Treg）、巨噬细胞、细胞因子网络（如IL-17, IFN-γ, IL-23, IL-1β等）、趋化因子、黏附分子等在疾病中的作用。
- 新治疗策略评估：
- 免疫抑制剂/生物制剂： 评估传统免疫抑制剂（如环孢素A、他克莫司、甲氨蝶呤）和新型生物制剂（如抗TNF-α、抗IL-6R、抗IL-17/IL-23单抗、JAK抑制剂）的疗效和安全性。
- 抗原特异性免疫疗法： 研究口服/黏膜耐受、肽段疫苗（修饰肽配体、耐受原性肽段）、Treg细胞过继转移等策略诱导免疫耐受的效果。
- 基因治疗/细胞治疗： 评估靶向特定基因或干/祖细胞治疗的潜力。
- 新型给药系统： 测试缓释制剂、纳米载体、眼内植入剂等提高药物眼内生物利用度和靶向性的策略。
- 诊断标志物探索： 寻找与疾病活动度相关的血清、房水或影像学生物标志物。
六、 模型特点与注意事项
- 优点：
- 高度模拟人类自身免疫性葡萄膜炎的免疫病理特征。
- 诱导成功率高、重复性好、发病时间相对可控。
- 可根据研究目的选择不同物种、品系、肽段及免疫方案。
- 局限性与注意事项：
- 动物模型无法完全人类疾病的复杂性和异质性。
- 不同品系动物对同一肽段的易感性差异显著，需谨慎选择。
- 免疫方案（肽段剂量、佐剂种类与量、PTX使用与否及剂量、注射部位）显著影响疾病严重程度和表型，需严格优化和标准化。
- 需严格遵守动物伦理规范，采取一切措施减轻动物痛苦（如使用镇痛药、及时人道终点处死）。
- 组织病理学是金标准，但需专业人员进行评分以避免主观偏差。临床评分和无创影像学检查对动物操作技术要求高。
结论
利用特定免疫原性肽段诱导的大小鼠EAU模型，已成为深入探究葡萄膜炎自身免疫发病机制和评估新型治疗干预措施的核心平台。该模型以其靶向性、可重复性和可控性优势，极大地推动了我们对葡萄膜炎病理生理的理解，并为开发更安全有效的临床治疗方案提供了重要的临床前数据支撑。随着肽段筛选技术的优化、无创成像技术的发展以及免疫学研究方法的进步，肽段诱导的EAU模型将继续在该领域发挥不可替代的关键作用。持续优化模型标准化、探索更贴近人类疾病的改良模型（如慢性复发模型、多肽联合模型）是未来重要方向。