MBP诱导大鼠急性EAE

MBP诱导大鼠急性实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型

摘要：
实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是研究多发性硬化（MS）发病机制和治疗的重要动物模型。本实验采用髓鞘碱性蛋白（MBP）主动免疫大鼠，成功构建急性EAE模型，模拟了MS的部分临床及病理特征，为探讨自身免疫性中枢神经系统脱髓鞘疾病提供了可靠工具。

一、 引言
多发性硬化（MS）是一种以中枢神经系统（CNS）炎性脱髓鞘为主要特征的自身免疫性疾病。EAE是通过特定髓鞘抗原（如MBP、MOG、PLP）加佐剂免疫易感动物而诱导的经典模型，在理解MS发病机制、免疫应答及药物筛选方面具有重要价值。其中，MBP诱导的大鼠急性EAE模型因其易于诱导、临床症状明确且易于观察而被广泛应用。

二、 材料与方法

1. 实验动物：

   • 选用高度敏感的雌性Lewis大鼠（6-8周龄）。饲养于恒温恒湿、12小时光暗循环的无特定病原体（SPF）级环境中，自由摄食饮水。实验前适应环境至少一周。
   • 实验伦理：所有操作均遵循动物福利伦理委员会的相关规定并获得批准。

2. 主要试剂与配制：

   • 抗原： 豚鼠脊髓来源的髓鞘碱性蛋白（MBP）。
   • 完全弗氏佐剂（CFA）： 液体石蜡与灭活分枝杆菌（如结核杆菌H37Ra）的乳化混合物。
   • 百日咳毒素（PTX）： 用于增强血脑屏障通透性及免疫应答。
   • 抗原/佐剂乳剂制备： 将适量MBP溶解于生理盐水中（终浓度通常为1-2 mg/ml）。与等体积CFA在冰水浴中充分乳化，直到形成稳定的油包水（W/O）乳剂（滴入冷水表面不扩散）。

3. EAE诱导流程：

   • 免疫日（第0天）： 在大鼠背部脊柱两侧多个点（通常4-6点）或尾根部单点，皮下注射新鲜制备的MBP/CFA乳剂（通常每只注射0.1-0.2 ml，含MBP 50-100 μg）。
   • 百日咳毒素注射（可选但强烈推荐）： 在免疫当天（第0天）和免疫后48小时（第2天），腹腔或尾静脉注射百日咳毒素（通常剂量为200-500 ng/只溶于生理盐水）。
   • 每日观察与评分： 从免疫后约第7天开始，每日定时对所有大鼠进行临床神经功能评分，记录体重变化。

4. 临床评分标准（常用0-5分制）：

   • 0分：无临床症状。
   • 1分：尾部张力丧失（尾巴末端下垂无力）。
   • 2分：后肢无力（行走轻微拖沓或不稳）。
   • 3分：单侧或双侧后肢部分瘫痪（无法支撑身体）。
   • 4分：双侧后肢完全瘫痪（拖行）或伴有前肢无力。
   • 5分：濒死状态（垂死）或死亡。
   • (注：动物体重下降≥15%也应人道终点处死)

5. 样本采集（通常在发病高峰期或预设时间点）：

   • 麻醉与灌注取材： 深度麻醉大鼠，经心脏灌注大量冰冷生理盐水清除血液，随后灌注4%多聚甲醛固定。
   • 组织取材： 取出脑和脊髓组织。
   • 固定与包埋： 固定后组织经脱水、透明、石蜡包埋或蔗糖梯度脱水后OCT包埋进行冰冻切片。
   • 组织学染色：
     • 苏木素-伊红（H&E）染色： 观察炎症细胞（单核细胞、淋巴细胞）的浸润情况（血管套袖形成、实质浸润）。
     • 卢克索坚牢蓝（LFB）染色： 特异性染色髓鞘，评估脱髓鞘程度。
     • 免疫组织化学（IHC）： 标记特定细胞类型（如CD3+ T细胞、CD68+巨噬细胞/小胶质细胞、GFAP+星形胶质细胞）或分子（如MBP、MOG、NF200神经丝蛋白）。

三、 结果

1. 临床病程：

   • 潜伏期： 免疫后约9-12天（受MBP纯度、剂量、大鼠状态等因素影响）。
   • 发病期： 通常在免疫后第10-14天症状快速达到高峰（急性期）。典型的临床症状呈现为进行性地从尾部松弛无力发展为后肢部分或完全瘫痪（评分多达到2至4分）。
   • 恢复期： Lewis大鼠模型具有自发缓解的特点。通常在发病高峰后1周左右开始恢复，大部分大鼠在免疫后3-4周内症状可基本或完全缓解（评分为0或1分）。此模型模拟了MS急性发作的单相过程。
   • 体重变化： 发病期间常伴随明显的体重下降（可达15-20%），恢复期体重逐渐回升。

2. 病理学特征：

   • 炎症浸润： H&E染色可见中枢神经系统（尤其脊髓腰膨大、胸髓、脑干、小脑等部位）血管周围及实质内显著的单个核细胞（主要为T淋巴细胞和巨噬细胞）浸润，形成特征性的“血管套袖”现象（图1A）。
   • 脱髓鞘： LFB染色清晰显示脊髓白质（尤其是侧索、腹索）存在局灶性或融合性斑块状的脱髓鞘病灶（图1B）。病灶区域蓝染的髓鞘结构消失或变淡。
   • 胶质细胞活化： IHC显示病灶区域小胶质细胞（CD68/Iba1+）和星形胶质细胞（GFAP+）显著活化增生（图1C）。

四、 讨论

1. 模型机制：

   • MBP抗原被抗原提呈细胞（APC）摄取、处理。
   • 活化的APC迁移至引流淋巴结，将MBP肽段呈递给特异性CD4+ T细胞（主要是Th1和Th17细胞）。
   • 活化增殖的MBP特异性T细胞穿越血脑屏障（PTX在此过程中起关键作用）。
   • 浸润CNS的特异性T细胞被局部APC（如小胶质细胞）再次激活，释放促炎因子（如IFN-γ, IL-17, TNF-α）。
   • 募集大量其他免疫细胞（巨噬细胞、B细胞等）。
   • 炎症介质、活性氧、蛋白酶等导致少突胶质细胞损伤、髓鞘破坏（脱髓鞘）以及轴突损伤。
   • 胶质细胞（星形胶质细胞和小胶质细胞）过度活化，形成胶质瘢痕，并持续释放炎症因子。

2. 模型优势：

   • 可预测性强： 在敏感品系（如Lewis大鼠）中发病率高（接近100%），临床发病时间相对集中，症状典型。
   • 重现性好： 易于，模型稳定性高。
   • 急性单相性： 模拟MS的急性发作/单相病程（如急性播散性脑脊髓炎-ADEM）。
   • 明确的抗原靶点： MBP是关键的自身抗原，机制研究相对清晰。
   • 组织病理直观： 炎症和脱髓鞘病变显著，易于观察和定量分析。

3. 模型局限性：

   • 非完全人源化： 使用啮齿类动物模型，与人类MS在解剖、免疫系统细节上存在差异。
   • 急性单相病程： 难以模拟MS最常见且复杂的复发-缓解型（RRMS）或继发进展型（SPMS）的慢性反复病程（需选用其他品系或抗原建立慢性EAE模型）。
   • 异源性抗原： 通常使用啮齿类或豚鼠的MBP，与人源MBP存在差异。
   • 佐剂和PTX的“非生理性”： CFA和PTX的使用是强力的免疫刺激，部分机制可能不完全等同于人类MS的自然发病。
   • 病理分布差异： 病变主要集中于脊髓，而人类MS的脑部病灶（尤其皮层）更为突出。

4. 应用价值：
   该模型是研究MS/中枢神经系统自身免疫炎症的核心工具：

   • 基础机制研究： 探索自身免疫反应诱导、T细胞活化迁移、炎症级联反应、血脑屏障破坏、脱髓鞘、轴突损伤、胶质细胞反应等机制。
   • 药物筛选与评价： 测试潜在治疗药物的有效性（减轻临床症状、减少炎症浸润、保护髓鞘/轴突）和安全性。
   • 免疫调节策略研究： 评估免疫耐受诱导、细胞治疗等新型疗法的效果。
   • 诊断生物标志物探索： 在模型血浆/脑脊液中寻找潜在生物标志物。

五、 结论
采用MBP联合CFA辅以PTX免疫Lewis大鼠，可成功诱导出急性单相的EAE模型。该模型临床发病集中、症状典型，病理上表现出显著的血管周围及实质炎性浸润和中枢神经脱髓鞘特征，高度模拟了人类MS的核心病理生理过程。尽管存在某些局限性（如急性单相病程、佐剂依赖性），MBP诱导的大鼠急性EAE模型因其可靠性和可重复性，仍然是研究多发性硬化及其他中枢神经系统自身免疫性脱髓鞘疾病发病机制、评估潜在治疗策略不可或缺的重要工具。未来研究应结合慢性模型、人源化模型及先进技术手段，以更全面地揭示疾病本质并推动转化医学研究。

(图注：图1. MBP诱导的Lewis大鼠急性EAE病理改变。 A. H&E染色显示脊髓白质血管周围大量炎性细胞浸润（血管套袖，箭头所示）。 B. LFB染色显示脊髓白质区域明显的脱髓鞘病灶（蓝色髓鞘缺失区域，箭头所示）。 C. IHC染色（CD68）显示活化的小胶质细胞/巨噬细胞在病灶处大量聚集（棕色染色）。标尺：A, B, C = 100 μm)