DNFB诱导DTH反应在小鼠/大鼠及转基因模型中的应用
摘要：
2,4-二硝基氟苯（DNFB）诱导的迟发型超敏反应（DTH）模型是研究T细胞介导的接触性超敏反应（CHS）及适应性免疫应答的核心实验平台。该模型在野生型小鼠/大鼠及转基因动物中广泛应用，为阐明免疫机制、评估免疫调节策略及研究特定基因功能提供了关键工具。
一、简介
迟发型超敏反应（DTH），又称接触性超敏反应（CHS），是主要由CD4+ Th1和CD8+ Tc1细胞介导的抗原特异性IV型超敏反应。DNFB作为半抗原（hapten），穿透表皮后与皮肤组织蛋白共价结合形成完全抗原，触发一系列复杂的免疫级联反应。该模型特征性地再现了人类接触性皮炎等疾病的炎症过程，具有高度的可重复性和可控性。
二、实验动物
- 物种与品系：
- 小鼠： 最常用物种。常用品系包括C57BL/6、BALB/c等近交系。选择取决于研究目的（如C57BL/6偏向Th1反应）。
- 大鼠： 如Sprague-Dawley、Wistar等品系也可使用，原理相似，模型建立需调整浓度和剂量。
- 转基因/基因敲除小鼠/大鼠： 用于研究特定基因在DTH中的功能。常见类型包括：
- 细胞因子或其受体基因修饰动物（如IFN-γ KO, IL-4 KO, IL-17 KO, IL-1R KO）。
- 趋化因子或其受体基因修饰动物。
- 粘附分子基因修饰动物（如ICAM-1 KO）。
- 抗原提呈细胞（APC）功能相关基因修饰动物（如树突细胞特异性基因缺失）。
- T细胞信号通路关键分子基因修饰动物（如TCR转基因模型、NFATc1 KO、STAT蛋白KO）。
- 免疫检查点分子基因修饰动物（如CTLA-4 KO, PD-1 KO）。
- 动物准备： 实验前动物需在SPF级环境中适应至少一周。通常使用6-12周龄小鼠或体重匹配的大鼠。动物实验需严格遵守伦理规定并获得机构审查委员会批准。
三、实验材料
- 主要试剂：
- 2,4-二硝基氟苯（DNFB）。
- 溶剂：丙酮与橄榄油的混合液（AOO，常用比例为丙酮:橄榄油 = 3:1 或 4:1）。注意：浓度均指DNFB在溶剂中的百分比（w/v），溶剂体积固定不变。
- 麻醉剂（如异氟烷或苯巴比妥钠）。
- 磷酸盐缓冲液（PBS）。
- 组织固定液（如10%中性福尔马林）。
- 仪器设备：
- 精密电子秤。
- 微量移液器及吸头。
- 动物剃毛器/脱毛剂。
- 厚度测量工具（游标卡尺或专用耳厚测量仪）。
- 打孔器（用于耳组织取样活检）。
- 组织处理及切片设备。
- 光学显微镜。
- 流式细胞仪及相关试剂（如需分析免疫细胞）。
- 酶标仪及ELISA试剂盒（如需检测细胞因子）。
四、实验流程（以小鼠为例）
- 致敏阶段（Day 0）：
- 动物分组（对照组、实验组、转基因组等）。
- 剃除或脱去小鼠腹部毛发（约2cm x 3cm区域），避免损伤皮肤。
- 将 25µl 的 0.5% DNFB（溶于AOO中） 均匀涂抹于剃毛区域皮肤进行致敏。对照组动物涂抹等体积的 AOO溶剂（不含DNFB）。
- 待溶剂完全挥发（约5-10分钟）。
- 激发阶段（Day 5）：
- 轻轻剃除或脱去小鼠一侧（通常为左耳）耳廓部分背腹面毛发（可选，便于准确测量）。
- 将 10µl 的 0.3% DNFB（溶于AOO中） 均匀涂抹于小鼠一侧耳廓的背部和腹面进行激发。激发部位必须不同于致敏部位（腹部）。至关重要！
- 对照组：
- 阴性对照（Vehicle Control）： 涂抹 10µl AOO溶剂 于同侧耳廓。
- 阳性对照（Sensitized Only Control）： 仅接受腹部致敏但不进行耳部激发（可选，评估致敏是否产生系统性效应但对于局部激发是否必要）。
- 非致敏激发对照（Naive Challenge）： 未致敏动物涂抹 10µl 0.3% DNFB 于耳部（排除DNFB本身直接刺激）。
- DTH反应评估（通常在激发后24或48小时进行）：
- 耳肿胀度测量（核心指标）：
- 在激发前（Day 5激发前）和激发后特定时间点（通常24h和48h），使用精密厚度测量工具（如游标卡尺）测量激发耳和未激发（右耳）或溶剂对照耳的厚度。多点测量取平均值。
- 耳肿胀度 = 激发后耳厚度均值 - 激发前该耳厚度均值（基线）。或计算相对肿胀度：(激发耳厚度 - 未激发耳厚度) / 未激发耳厚度 x 100%。
- 临床评分（可选）： 肉眼观察耳部红斑、水肿、硬结程度进行评分（如0：无反应；1：轻微红斑；2：明显红斑水肿；3：严重红斑水肿伴硬结）。
- 组织学分析：
- 激发后24-72小时（通常48小时峰值）处死动物。
- 无菌操作剪取激发耳和对照耳（通常是未激发耳或溶剂处理耳）。
- 使用打孔器获取直径一致的耳组织样本。
- 称重：耳肿胀重量 = 激发耳样本重量 - 对照耳样本重量（精确反映水肿和细胞浸润）。
- 固定、包埋、切片、染色（H&E）：评估表皮海绵水肿、真皮炎症细胞浸润（主要是单核细胞、淋巴细胞）、血管扩张程度。可进行免疫组化（IHC）或免疫荧光（IF）分析特定细胞类型（如CD3+ T细胞）或分子表达。
- 流式细胞术分析（可选）： 分离耳引流淋巴结（耳后淋巴结）或浸润耳组织的细胞，分析T细胞亚群比例（如CD4+, CD8+, Foxp3+ Treg）、活化状态（CD44hi CD62Llo）及胞内细胞因子产生（IFN-γ, IL-17, IL-4等）。
- 细胞因子检测（可选）： 取耳组织匀浆上清或血清，使用ELISA或多重液相芯片技术检测炎性细胞因子（如IFN-γ, TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-17）水平。
- 耳肿胀度测量（核心指标）：
五、转基因模型的应用关键点
- 设立严谨对照：
- 必须使用同窝出生的野生型（WT）动物或遗传背景高度匹配的对照品系动物进行平行实验。
- 确保转基因动物和对照组动物在相同环境下饲养和处理。
- 表型分析：
- 定量分析： 精确测量耳肿胀度（厚度、重量差值）。
- 定性/机制分析：
- 组织病理学评估炎症程度和细胞浸润特征的变化。
- 检测引流淋巴结T细胞活化、增殖、分化状态（流式）。
- 分析局部（耳组织）和/或系统性（血清）细胞因子/趋化因子谱的改变（ELISA/Luminex）。
- 评估特定细胞亚群（如调节性T细胞、中性粒细胞）的数量和功能变化。
- 结果解读：
- 比较转基因动物与对照动物的DTH反应强度（耳肿胀度）和动力学。
- 结合细胞和分子水平的分析结果，阐释目标基因缺失或过表达对DTH反应中抗原识别、T细胞活化与分化、效应细胞迁移、组织炎症损伤等具体环节的影响机制。
六、优点
- 模型可靠、可重复性好。
- 反应强度易于定量评估（耳肿胀）。
- 时间进程相对较短（5-7天）。
- 适用于多种品系小鼠、大鼠及转基因/基因敲除模型。
- 可进行深入的细胞和分子机制研究。
- 模拟人类接触性超敏反应。
七、注意事项与局限性
- 安全： DNFB为强致敏物和刺激物，操作必须在通风橱中进行，佩戴手套、护目镜和实验服。
- 标准化：
- 严格控制DNFB浓度（精确称量）、溶剂配比、涂抹体积和方法。
- 操作人员需手法一致，确保试剂均匀覆盖皮肤/耳廓。
- 环境温度、湿度可能影响结果，尽量保持稳定。
- 动物个体差异存在，需保证足够样本量（每组通常n≥5）。
- 动物福利：
- 密切监测动物激发后的疼痛和不适（耳部红肿、抓挠）。
- 根据伦理要求和动物状态，及时给予镇痛药（如布洛芬饮水或美洛昔康注射）或实施仁慈终点（如耳部严重坏死）。
- 严格遵守3R原则（替代、减少、优化）。
- 局限性：
- 主要反映皮肤局部的急性炎症反应，对慢性过程或系统效应的模拟有限。
- 耳肿胀是水肿和细胞浸润的综合结果，需结合组织学等手段深入解析。
- 不同品系小鼠对DNFB敏感性存在差异。
- 转基因模型可能存在发育代偿或其他非预期效应，解读需谨慎。
八、结论
DNFB诱导的DTH模型是研究接触性超敏反应及T细胞介导免疫应答的经典且强大的工具。通过在健康的野生型动物和基因工程动物（转基因/基因敲除小鼠/大鼠）中运用该模型，结合精确的耳肿胀测量、细致的组织病理学分析以及先进的细胞分子生物学技术，能够深入揭示调控DTH反应发生发展的关键免疫分子和信号通路。该模型在基础免疫机制探索、自身免疫性疾病和过敏性炎症研究、以及新型免疫治疗方法或药物的临床前评价中具有不可替代的价值。严谨的实验设计、规范的操作流程、对动物伦理的高度重视，是确保实验结果科学可靠和可重复性的基石。
重要声明：
- 本方案为通用性描述，具体实验参数（如最佳DNFB浓度、激发时间点、麻醉剂种类和剂量、镇痛方案、取材时间等）可能因动物品系、年龄、研究目的不同而需要优化调整。务必查阅最新文献并结合预实验结果确定最佳条件。
- 所有动物实验必须严格遵守所在国家/地区及研究机构的伦理规范和法律法规，获得动物伦理委员会的批准后方可进行。