骨髓移植诱导小鼠急性移植物抗宿主病（aGvHD）模型：构建、机制与评价
引言
移植物抗宿主病（Graft-versus-host disease, GvHD）是同种异体造血干细胞移植（allo-HSCT）后主要的并发症和致死原因之一。其中，急性GvHD（aGvHD）通常在移植后100天内发生，特征性地累及皮肤、肝脏和胃肠道。为深入研究其发病机制、病理生理过程及探索新型防治策略，建立可靠且标准化的小鼠aGvHD模型至关重要。本文详细阐述通过骨髓移植（Bone marrow transplantation, BMT）诱导小鼠aGvHD的实验方法与核心机制。
一、 模型构建原理
aGvHD的发生需要三个基本要素（“三重打击”学说）：
- 供体来源的免疫活性细胞： 主要是成熟的T淋巴细胞（包括CD4+和CD8+ T细胞），它们能识别宿主（受体）的组织相容性抗原。
- 组织不相容性： 供体与受体间存在主要组织相容性复合体（MHC，在小鼠中称为H-2复合体）差异（主要错配）或次要组织相容性抗原（miHA）差异（次要错配）。主要错配模型（如BALB/c [H-2d] → C57BL/6 [H-2b]）诱导的aGvHD较严重且典型。
- 宿主环境的促炎状态： 移植前对受体进行的清髓性预处理（放疗和/或化疗）造成组织损伤，释放大量炎症因子（如TNF-α, IL-1β, IL-6），上调宿主抗原呈递细胞（APC）的共刺激分子表达，为供体T细胞的活化、增殖和迁移攻击宿主组织创造了“许可”环境。
二、 实验材料与方法（核心步骤）
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动物选择：
- 供体小鼠： 选择与受体MHC主要错配或次要错配品系。常用组合如供体C57BL/6 (H-2b)，受体BALB/c (H-2d)；或供体BALB/c (H-2d)，受体C57BL/6 (H-2b)。需保证供受体遗传背景清晰、健康、无特定病原体（SPF）感染。
- 受体小鼠： 通常为8-12周龄雌性（体型较小便于操作），雄性也可用。
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受体预处理：
- 目的： 清除受体自身造血和免疫系统（腾出骨髓龛），抑制宿主对移植物的排斥反应（移植物排斥），创造促炎环境。
- 方法： 移植前1天进行全身照射（Total Body Irradiation,TBI）。常用剂量为单次7-10 Gy（取决于品系敏感性，需预实验确定死亡率低于10%的清髓剂量）。照射设备需精度可靠。
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供体细胞制备：
- 骨髓细胞分离：
- 处死供体小鼠，无菌条件下取出股骨和胫骨。
- 用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）或培养基冲洗骨髓腔，获取骨髓细胞悬液。
- 通过红细胞裂解液去除红细胞。
- 用细胞筛过滤去除组织碎块，获得单细胞悬液。
- 计数有核细胞数量。
- 脾细胞分离（模拟移植物中T细胞）：
- 处死供体小鼠，无菌取出脾脏。
- 研磨脾脏并通过细胞筛制备单细胞悬液。
- 红细胞裂解后获得脾单个核细胞悬液。
- 计数有核细胞数量。
- 移植物构成：
- 单纯骨髓移植（BMT）： 通常不足以诱导严重aGvHD（除非在强烈错配背景下），主要用于造血重建研究。
- 骨髓加脾细胞移植（BMT + Spleen Cell）： 最常用模型。将一定数量（如5x10^6）的供体骨髓细胞（重建造血）与富含T细胞的供体脾细胞悬液（诱导GvHD）混合。脾细胞中T细胞含量是关键，通常按比例加入（如每只受体输入2-5x10^6个脾细胞）。
- 骨髓细胞分离：
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细胞输注：
- 受体接受照射后6-24小时内，通过尾静脉注射途径将制备好的供体细胞混合悬液（溶于无菌PBS或无血清培养基）缓慢注入受体小鼠体内。
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支持治疗：
- 移植后一段时间内（约1-2周），受体小鼠抵抗力极低，需置于严格无菌条件的隔离饲养环境中（如层流架或隔离器）。
- 提供灭菌饲料和酸化饮用水（含抗生素，如磺胺甲恶唑+甲氧苄啶）以预防感染。
三、 急性GvHD的临床表现与监测
移植后需密切观察并记录受体的生存状态和临床症状：
- 生存率监测： 每日记录死亡率，绘制生存曲线（Kaplan-Meier分析）。
- 临床评分： 定期（如每周2-3次）依据标准化评分系统对小鼠进行评估，通常包括以下方面：
- 体重减轻百分比： （初始体重-当前体重）/初始体重 x 100%。是aGvHD严重度的敏感指标。
- 活动状态： 评估活力、驼背姿势、竖毛情况。
- 皮毛状况： 评估毛发粗糙、脱毛、完整性。
- 皮肤变化： 观察红斑、皮疹、溃疡（尤其耳、足、尾）。
- 腹泻： 评估粪便粘稠度（稀便、水样便）及肛门污渍情况。
- 将各项评分相加得到总临床评分（例如0-10分），评分越高表明aGvHD越严重。
四、 病理学评估（终点分析）
为客观评估aGvHD的靶器官损伤，通常在实验终点（如出现严重症状时或预定时间点）人道处死小鼠，采集主要靶器官进行组织病理学检查：
- 样本采集： 取皮肤（背部和耳部）、肝脏（左叶或中叶）、小肠（空肠/回肠）、大肠（结肠）等组织。
- 组织处理： 福尔马林固定，石蜡包埋，切片（3-5μm）。
- 染色： 常规苏木精-伊红（H&E）染色。
- 病理评分： 由病理学家在单盲或双盲条件下，根据公认的组织学评分标准进行：
- 皮肤： 评估表皮层基底细胞空泡变性/凋亡、真皮层炎症浸润程度、毛囊损伤等。
- 肝脏： 评估胆管上皮变性/炎症、门静脉区炎症浸润（尤其小叶间胆管周围）、肝实质细胞坏死等。
- 小肠/大肠： 评估隐窝上皮细胞凋亡（单个或成簇）、隐窝丢失或萎缩、黏膜层炎症浸润、绒毛萎缩等。
- 每个器官根据损伤程度评分（如0-4分），计算总分或平均分。
五、 免疫学机制与分子事件
该模型重现了aGvHD的核心病理生理过程：
- 预处理损伤： TBI导致宿主组织（尤其是胃肠道和皮肤）损伤，释放大量损伤相关分子模式（DAMPs）。宿主APC（树突状细胞DC等）被激活，上调MHC和共刺激分子（CD80, CD86）表达，并分泌促炎因子（TNF-α, IL-1β, IL-6）。
- 供体T细胞活化与增殖： 输入的供体成熟T细胞（主要是幼稚T细胞）被宿主APC提呈的异体抗原（MHC或miHA）激活。在炎症信号（如IL-12）驱动下，T细胞发生克隆性增殖和分化，Th1和Tc1细胞（产生IFN-γ, TNF-α）往往占主导。
- 细胞因子风暴： 活化的供体T细胞和受损宿主组织产生大量促炎细胞因子（IFN-γ, TNF-α, IL-1, IL-6等），形成自我放大的“细胞因子风暴”，是造成广泛组织损伤的关键。
- 效应细胞迁移与靶器官损伤：
- 活化的供体T细胞在趋化因子引导下迁移至靶器官。
- 皮肤： 细胞毒性T淋巴细胞（CTL）攻击表皮基底细胞和附属器；炎症因子导致角化细胞凋亡。
- 肝脏： CTL攻击胆管上皮细胞（表达高水平MHC I类分子），导致胆管炎；炎症因子造成肝细胞损伤。
- 肠道： CTL攻击肠道隐窝干细胞和上皮细胞，导致隐窝细胞凋亡、黏膜屏障破坏；炎症因子进一步加剧损伤；肠道菌群及其产物（如LPS）易位进入血液循环，进一步放大全身炎症反应。
- 组织病理后果： 上述过程最终导致皮肤红斑/脱屑/溃疡、胆汁淤积性肝炎/黄疸、严重腹泻/体重下降/营养不良等典型临床表现。未经控制的重度aGvHD最终导致多器官衰竭和死亡。
六、 模型应用价值
该标准化小鼠aGvHD模型在基础与转化研究中具有核心价值：
- 机制研究： 深入解析aGvHD发生发展中涉及的特定免疫细胞亚群（如Treg, Th17, Tfh, NK细胞、巨噬细胞亚型）、信号通路（如TLR/MyD88, JAK/STAT, Notch）、细胞因子网络、组织损伤机制（凋亡、坏死、焦亡）、肠道菌群作用等。
- 新型防治策略评估：
- 免疫抑制药物： 测试新型免疫抑制剂或优化现有药物方案（如钙调磷酸酶抑制剂、mTOR抑制剂、JAK抑制剂等）的疗效和毒性。
- 细胞治疗： 评估调节性T细胞（Treg）、间充质干细胞（MSC）或其他免疫调节细胞的治疗潜力。
- 靶向治疗： 测试针对特定细胞因子（如抗TNF-α, 抗IL-6R）、趋化因子受体、共刺激/共抑制分子（如抗CD28, CTLA4-Ig, 抗PD-1/PD-L1需谨慎）、炎症小体等的抗体或小分子药物的效果。
- 预防策略： 探索体外或体内去除移植物中致病性T细胞（如T细胞清除）、选择性保留调节性细胞、调控肠道菌群等方法。
- 移植物抗白血病效应（GVL）研究： 在接种了白血病/肿瘤细胞的小鼠模型中，可同步研究aGvHD和GVL的关系，寻找既能控制GvHD又不削弱GVL的策略（如选择性耗减致病T细胞亚群）。
七、 模型局限性
- 物种差异： 小鼠免疫系统与人类存在差异（如细胞因子功能、趋化因子受体表达谱等），模型结果外推到人体需谨慎。
- 环境因素： 饲养环境（微生物群落）、实验操作细节（照射剂量准确性、细胞制备纯度活力）等对疾病发生发展影响显著，需严格标准化。
- 模型异质性： 不同品系组合、预处理强度、移植物T细胞含量等因素导致模型严重程度和动力学存在差异。
- 慢性GvHD（cGvHD）模拟不足： 标准aGvHD模型主要模拟急性过程，难以完全重现人类cGvHD的自身免疫和纤维化特征，需要不同的模型构建策略。
结论
骨髓联合脾细胞移植诱导的小鼠急性GvHD模型，通过模拟供受体间组织不相容性、移植前预处理损伤和供体T细胞输注这三个关键环节，成功地再现了人类aGvHD的核心病理生理特征，包括特征性的靶器官损伤和系统性炎症反应。该模型操作相对成熟、结果可重复性高、成本可控，是目前研究aGvHD发病机制和探索新型防治策略最常用且不可替代的工具之一。深入理解该模型的构建原理、评估标准和内在机制，对于设计和解读GvHD相关实验研究具有重要意义。持续优化模型、结合新型技术（如单细胞测序、多组学分析）将推动对aGvHD更精准的理解和治疗。