溶血/皮肤刺激性

溶血性与皮肤刺激性评估：机制、方法与应用

引言
在药品、医疗器械、化妆品及化工产品的研发与安全评价中，溶血性与皮肤刺激性是两项至关重要的生物相容性指标。它们直接关系到产品接触人体时的安全性。本文将系统阐述这两类反应的核心概念、发生机制、标准化评估方法及其在安全评价体系中的关键意义。

一、 溶血性评估

• 定义与机制：

  • 溶血性指某些物质引起红细胞破裂（溶血），导致血红蛋白释放的特性。该过程可通过多种机制发生：
    • 物理化学作用： 表面活性剂破坏红细胞膜脂质双分子层；极端pH值或高渗/低渗环境导致渗透压失衡。
    • 免疫介导反应： 某些物质（如药物）作为半抗原与红细胞膜蛋白结合，诱发抗体产生，通过补体激活途径溶解红细胞（免疫溶血）。
    • 氧化损伤： 强氧化剂直接损伤红细胞膜或血红蛋白。
  • 危害： 溶血释放的血红蛋白可导致肾损伤、血红蛋白尿、贫血，严重时危及生命（如急性血管内溶血）。

• 标准检测方法：

  • 体外直接接触法（主流方法）：
    • 原理： 将测试材料或其浸提液与新鲜抗凝稀释的兔或人血液（含抗凝剂如枸橼酸钠或肝素）在特定条件下（如37°C）孵育一定时间（通常数小时）。
    • 观察与定量：
      • 肉眼/显微镜观察： 孵育后离心，观察上清液颜色（溶血越严重，红色越深）和沉淀红细胞形态。
      • 分光光度法（标准方法）： 测定上清液在特定波长（如540nm或575nm附近）的吸光度值（OD值），定量释放的血红蛋白含量。
      • 溶血率计算： 将测试样本的吸光度值与阳性对照（如蒸馏水，引起完全溶血）和阴性对照（如生理盐水，无溶血）进行比较，计算溶血率（%）。
    • 关键要素： 血液来源与处理、材料/浸提液制备（如浸提介质、比例、温度、时间）、孵育条件、阳性/阴性对照设置、溶血率判定标准（如通常认为<5%为可接受）。
  • 体内试验（补充或特定情况）： 在动物模型中（如兔、狗）静脉给予受试物，监测血液学指标（红细胞计数、血红蛋白、网织红细胞、血浆游离血红蛋白、结合珠蛋白等）和器官（如肾脏）病理变化。通常用于验证体外结果或研究复杂机制。

• 结果解读与应用：

  • 体外溶血试验是筛选材料血液相容性的关键初筛步骤。
  • 溶血率是量化指标，需结合具体产品类型和应用场景的法规要求进行判定。
  • 阳性结果提示存在溶血风险，需进行深入机制研究、配方优化或风险评估，必要时终止开发。

二、 皮肤刺激性评估

• 定义与机制：

  • 皮肤刺激性指物质在皮肤接触部位（通常单次或短期多次应用）引起的可逆性炎症反应。主要特征是红斑（发红）和水肿（肿胀）。
  • 皮肤腐蚀性指物质在皮肤接触部位引起的不可逆性组织损伤（坏死），穿透表皮到达真皮。
  • 机制： 刺激物通过破坏皮肤屏障功能、诱导炎症介质释放（如组胺、前列腺素、细胞因子）、直接损伤角质形成细胞或真皮细胞等途径引发炎症反应。

• 标准检测方法：

  • 体外替代方法（日益成为主流）：
    • 重建人表皮模型（RhE）测试： 使用商品化的三维人体表皮模型（如EpiDerm™, EpiSkin™, SkinEthic™ RHE）。将受试物直接作用于模型表面，孵育后通过检测细胞活力（如MTT法）来评估细胞毒性。细胞活力降至某个阈值（通常低于50%）以下，可预测该物质具有腐蚀性或严重刺激性。这是OECD和欧盟认可的完全替代动物实验的方法。
    • 膜屏障测试（如Corrositex®）： 基于受试物穿透胶原蛋白膜屏障并引起下方化学指示剂颜色变化的速度，来预测腐蚀性。适用于特定化学类别。
  • 体内动物试验（传统方法，使用受限）：
    • 兔皮肤刺激/腐蚀试验（Draize Test）： 历史上常用。将受试物单次涂敷于剃毛的兔背部皮肤（通常3只兔，各2个位点），封闭固定时间（通常4小时）。在去除受试物后的不同时间点（如1, 24, 48, 72小时），观察并评分红斑和水肿程度，计算原发性刺激指数（PII）。根据PII值或腐蚀性出现的时间判断刺激性或腐蚀性。由于其动物福利问题，现已被体外方法大量替代，仅用于法规明确要求或体外方法不适用的复杂情况。
  • 人体试验（如斑贴试验）： 在确保安全的前提下，可用于最终产品在志愿者身上的温和刺激性和致敏性评估（如重复刺激斑贴试验）。

• 结果解读与应用：

  • 体外方法（尤其是RhE测试）已成为预测皮肤腐蚀性和严重刺激性的首选和法规接受的方法。
  • 体内试验结果需严格依据评分标准解读，PII值高低反映刺激性强弱。
  • 皮肤刺激阳性结果直接影响产品标签（如标注“刺激性”）、使用说明和安全防护要求。腐蚀性物质通常被严格限制使用或禁止。

三、 在安全评价体系中的核心地位

1. 法规强制要求： 全球主要监管机构（如FDA、EMA、NMPA/国家药监局、OECD）的指南（如ISO 10993系列医疗器械标准、化妆品安全评价技术规范、化学品注册法规如REACH）均将溶血性和皮肤刺激性列为关键的安全性评价终点。
2. 风险识别与管控： 这些测试是识别产品潜在生物危害的重要工具，为产品配方优化、材料选择、生产工艺改进、使用风险警示（标签、说明书）提供科学依据。
3. “3R”原则推动： 随着动物福利“3R”原则（替代、减少、优化）的深入贯彻，体外替代方法在溶血（如改进的体外模型）和皮肤刺激性（如RhE模型） 评估中得到了广泛应用和法规认可，代表了未来的发展方向。
4. 决策基石： 评估结果是产品能否进入临床试验、获得上市许可或安全使用的关键科学证据之一。

结论
溶血性和皮肤刺激性评估是保障人体健康安全不可或缺的科学环节。深入理解其发生机制，严格遵循标准化的体外和体内（在必要且符合伦理法规时）检测方法，科学解读评价结果，对于有效识别风险、指导产品安全开发和合规上市具有决定性意义。体外替代方法的持续发展和应用，不仅体现了科学进步，也践行了对动物福利的承诺，使安全评价体系更加完善和可持续。

参考文献：

• ISO 10993-4:2017 Biological evaluation of medical devices — Part 4: Selection of tests for interactions with blood.
• OECD Guideline No. 430: In Vitro Skin Corrosion: Transcutaneous Electrical Resistance Test (TER).
• OECD Guideline No. 431: In Vitro Skin Corrosion: Reconstructed Human Epidermis (RHE) Test Method.
• OECD Guideline No. 439: In Vitro Skin Irritation: Reconstructed Human Epidermis Test Method.
• 《化妆品安全技术规范》
• 《医疗器械生物学评价》（GB/T 16886系列标准）
• 《化学品测试方法 健康效应卷》（中国生态环境部）