酶/激酶筛选

发布时间：2025-06-30 11:35:08 阅读量：2 作者：生物检测中心

酶与激酶高通量筛选技术：原理、方法与前沿进展

酶（特别是激酶）作为生命活动的核心调控者，其在疾病发生（如癌症、神经退行性疾病、代谢紊乱）中的关键作用，使其成为药物研发的重要靶点。高效、准确地筛选针对特定酶/激酶的调节剂（抑制剂或激活剂），是现代药物发现流程的第一块基石。本文将系统剖析酶/激酶筛选的核心原理、主流技术策略、实验设计要点及其应用前景。

一、 筛选原理与目标

酶/激酶筛选的本质是检测候选分子对酶促反应速率（通常指初速度）的影响：

  • 抑制剂筛选： 寻找能降低酶催化反应速率或干扰其与底物/辅因子结合的分子。
  • 激活剂筛选： 寻找能提高酶催化反应速率或促进其活性的分子。
  • 核心观察指标：
    • 酶活性变化： 催化底物转化的效率（单位时间产物生成量或底物消耗量）。
    • 底物/产物浓度变化： 直接或间接测量反应体系中底物减少或产物增加的量。
    • 酶-配体相互作用： 检测候选分子与酶靶标的直接结合亲和力（通常作为初筛或验证）。
  • 关键参数： 筛选结果最终需量化计算抑制常数（Ki, IC50）或激活倍数（EC50）。
 

二、 主流筛选技术方法

筛选策略的选择取决于靶酶特性、筛选目的（高通量初筛 vs 低通量验证）、可用的仪器资源和预算。

(一) 基于酶活性的检测（功能筛选）

  1. 比色法（Colorimetric Assays）：

    • 原理： 反应产生的产物（或消耗的辅因子）具有与反应物不同的光吸收特性，可通过紫外-可见分光光度计检测吸光度变化。
    • 优点： 仪器普及、操作相对简单、成本较低。
    • 缺点： 灵敏度中等，易受有色化合物干扰（假阳性/阴性），动态范围有限。
    • 常用应用： 磷酸酶（PNPP底物产黄色对硝基酚）、某些蛋白水解酶（显色底物如AAPF-pNA）、氧化还原酶（NAD(P)H在340nm吸光度的变化）。

  2. 荧光法（Fluorescence Assays）：

    • 原理： 利用荧光信号的产生、淬灭、转移或偏振变化来指示酶反应。
      • 直接荧光： 产物本身具有荧光（如4-甲基伞形酮衍生物，用于水解酶、激酶）。
      • 荧光共振能量转移（FRET）： 酶切割连接供体/受体荧光团的肽段，打断FRET信号。
      • 时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）/ 均相时间分辨荧光（HTRF）： 使用长寿命镧系元素荧光（如铕穴状化合物）作为供体，降低背景干扰，提高信噪比。广泛应用于激酶（利用磷酸化特异性的抗体-受体识别配对）、蛋白-蛋白相互作用筛选。
      • 荧光偏振（FP）： 小分子荧光底物被酶催化后（如切割、磷酸化）分子量改变，导致旋转速度变化，进而荧光偏振值改变。常用于激酶、蛋白酶、核酸酶筛选。
      • 荧光淬灭/增强： 酶反应解除或产生淬灭效应。
    • 优点： 灵敏度高、通量高（适于HTS）、形式多样、可均相操作（减少步骤）。
    • 缺点： 可能受化合物自身荧光或淬灭特性干扰（需设置对照组验证），某些荧光染料昂贵。
    • 常用应用： 激酶筛选（FP, TR-FRET/HTRF为主流）、 蛋白酶筛选（FRET, FP）、磷酸酶筛选。

  3. 发光法（Luminescence Assays）：

    • 原理： 检测酶反应中产生的光子信号（化学发光或生物发光）。
      • 化学发光： 酶反应产物触发化学发光反应（如荧光素酶体系间接检测ATP消耗/产生）。
      • 生物发光： 利用生物发光蛋白（如荧光素酶）作为报告基因或ATP检测工具。
    • 优点： 灵敏度极高、背景极低（无激发光干扰）、动态范围宽、抗化合物干扰能力强。
    • 缺点： 信号持续时间可能较短（需精确计时），某些试剂盒成本较高。
    • 常用应用：
      • 激酶筛选（ATP消耗检测）： 常用基于萤火虫荧光素酶的系统检测反应后剩余ATP，发光强度与激酶活性负相关（如ADP-Glo™原理）。
      • 报告基因检测： 酶活性调控的报告基因表达驱动荧光素酶产生。
      • 蛋白酶/半胱天冬酶活性检测（基于特定底物释放氨基荧光素）。

  4. 放射性检测法（Radiometric Assays）：

    • 原理： 使用放射性同位素（如³²P, ³³P, ³⁵S, ¹⁴C）标记的底物（如ATP-γ-³³P用于激酶），酶反应后分离产物（常用磷酸纤维素膜过滤或离子交换层析），通过闪烁计数定量掺入产物的放射性。
    • 优点： 直接测量磷酸化事件，灵敏度高，通常被视为“金标准”。
    • 缺点： 操作繁琐耗时（非均相）、通量较低、涉及放射性废物处理、安全风险与法规限制。
    • 常用应用： 激酶筛选（尤其当非放射性方法难以建立或验证时）。

  5. 质谱法（Mass Spectrometry, MS）：

    • 原理： 直接检测和定量酶反应中的底物和产物分子（及其修饰状态，如磷酸化），基于其质荷比（m/z）。
    • 优点： 无需设计和标记特定底物、通用性强（可同时检测多种底物/产物）、提供直接化学信息、抗干扰能力强。
    • 缺点： 仪器昂贵、操作维护复杂、通量相对较低（尽管在提高）、样品前处理可能影响结果。
    • 常用应用： 激酶谱分析（Kinase Profiling）、多底物酶筛选、代谢酶筛选、新型酶靶标或难以标记底物的酶筛选、初筛后的验证和深入表征（如Ki测定）。
 

(二) 基于相互作用的检测（非功能筛选）

  1. 表面等离子体共振（Surface Plasmon Resonance, SPR）：

    • 原理： 将靶酶固定在传感器芯片表面，实时监测溶液中小分子候选物与酶结合和解离引起的折射率变化（响应单位RU），获得结合动力学参数（kon, koff）和亲和力（KD）。
    • 优点： 实时、无标记、可获取动力学信息、较少假阳性。
    • 缺点： 仪器昂贵、需要靶点固定（可能影响构象）、通量受限（相对于HTS）。
    • 应用： 苗头化合物（Hit）验证、片段筛选（FBDD）、结合动力学研究。

  2. 微量热泳动（MicroScale Thermophoresis, MST）：

    • 原理： 基于分子在温度梯度场中的定向运动（热泳动）差异进行检测。荧光标记的靶酶与不同浓度化合物孵育后，其热泳动轨迹变化反映分子结合状态。
    • 优点： 溶液中进行、样品消耗量极低（微升级）、适用范围广（缓冲液兼容性好）。
    • 缺点： 通常需要标记靶点（荧光染料），标记可能影响相互作用。
    • 应用： 小分子、肽、蛋白等与靶酶相互作用的亲和力（KD）测定，片段筛选。

  3. 热迁移分析/差示扫描荧光法（Thermal Shift Assay / Differential Scanning Fluorimetry, TSA/DSF）：

    • 原理： 结合配体通常能提高靶酶的热稳定性。通过监测酶蛋白在温度梯度下熔解温度（Tm）的变化（常用荧光染料如SYPRO Orange结合暴露的疏水区），推断化合物是否与靶酶结合。
    • 优点： 操作简单、成本低、通量较高、样品消耗少、无需固定或标记靶点。
    • 缺点： 无法区分结合模式（活性位点/变构位点），不能提供亲和力定量信息（是定性/半定量筛选），存在假阳性（如化合物影响荧光染料）。
    • 应用： 快速初筛、验证SPR/MST筛选结果、评估结合稳定性。
 

三、 酶/激酶筛选实验设计的关键考量要素

成功的筛选依赖于精心优化的实验方案：

  1. 靶点选择与制备： 重组酶（全长/催化结构域）的纯度、活性、浓度至关重要。需优化表达系统和纯化流程。
  2. 底物选择： 生理底物 vs 人工合成底物？需考虑酶的特异性、底物溶解性、稳定性及检测方法的兼容性（标记物类型）。
  3. 反应条件优化：
    • 缓冲液： pH、离子强度、还原剂（DTT/TCEP）、去垢剂（防非特异吸附/沉淀）。
    • 辅因子： 浓度（如ATP、Mg²⁺/Mn²⁺对于激酶）。
    • 反应温度与时间： 需在线性反应区间内进行测量。
    • 酶浓度： 通常选择在初速度范围内（[S] >> Km）且信号强度合适的浓度。
    • DMSO耐受性： 化合物通常溶于DMSO，需测试最高终浓度（通常≤1%）对酶活的抑制影响。
  4. 阳性/阴性对照： 强效抑制剂/激活剂（阳性对照），仅含溶剂（如DMSO）的反应（阴性对照/100%活性），无酶反应（背景空白）。
  5. 检测窗口（Signal-to-Background Ratio, S/B）与信噪比（Signal-to-Noise Ratio, S/N）： 需最大化目标信号（酶催化信号）与背景噪音（非特异信号）的比值（S/B ≥ 3通常可接受，S/N ≥ 10更理想）。
  6. 稳健性指标（Z’-Factor）： 评价整个筛选体系质量和可靠性的关键统计参数。Z’值介于0.5到1.0之间通常被认为适合高通量筛选（Z’ ≥ 0.5为可接受，≥ 0.6为良好）。
  7. 化合物干扰测试： 在正式大规模筛选前，测试已知干扰化合物（如强荧光/淬灭化合物）对信号的影响程度。
 

四、 应用与前沿发展趋势

酶/激酶筛选技术已深度融入药物研发管线：

  • 苗头化合物发现： 从大型化合物库（百万级）中快速鉴别活性分子。
  • 选择性评价： 通过激酶谱筛选等方法评估化合物对目标酶/激酶相对于其它同源酶的选择性。
  • 作用机制研究： 结合结构生物学等方法阐明抑制剂的作用模式（竞争性、非竞争性、变构抑制）。
  • 探针分子开发： 筛选获得高选择性、高亲和力的化学探针，用于靶标功能研究和验证。
  • 生物标志物发现： 筛选鉴定疾病相关酶/激酶的异常活性标志物。
 

前沿趋势聚焦：

  • 超高通量筛选（uHTS）： 微流控液滴技术（Droplet Microfluidics）将反应体系缩小至皮升-纳升级，结合自动化实现每日百万级通量。
  • 基于结构的理性设计（SBDD）与筛选融合： 结合靶酶结构信息进行虚拟筛选（VS）或设计聚焦库（Focused Library），提高筛选效率和质量。
  • 变构调节剂筛选： 开发针对传统活性位点以外调控位点的筛选策略，有望获得高选择性抑制剂。
  • 共价抑制剂筛选： 优化针对亲电弹头化合物的筛选方法和表征流程（关注选择性）。
  • 化学蛋白质组学（Chemoproteomics）： 利用基于活性的探针（Activity-Based Probes, ABPs）或光亲和探针（Photoaffinity Probes）在复杂细胞裂解物或活细胞中全局性筛选和鉴定与化合物相互作用的酶靶标。
  • CRISPR筛选辅助靶标验证： 利用CRISPR-Cas9功能基因组学筛选验证靶标在特定表型（如耐药性）中的作用，指导筛选方向。
  • 人工智能/机器学习： 应用于虚拟筛选、预测化合物活性/选择性、优化苗头化合物结构、分析筛选大数据。
 

五、 结论

酶/激酶筛选是一个高度多样化、快速发展的领域。从经典的比色法、放射性检测到高灵敏度的荧光、发光法和无标记的SPR、MST、TSA等技术，以及日新月异的质谱、微流控和化学蛋白质组学方法，科研人员拥有了强大的工具箱。这些技术的选择和应用，需要深入理解靶标生物学特性、筛选目的以及各种方法的原理与优劣势。成功的筛选依赖于严谨的实验设计、条件优化和质量控制（如Z’因子）。随着技术的不断创新与融合，特别是微流控、化学蛋白质组学、人工智能等前沿方向的突破，酶/激酶筛选正朝着更高通量、更高灵敏度、更贴近生理环境、更智能化以及更注重靶标选择性研究的方向迈进，从而持续推动创新药物与工具分子的发现进程。

注： 本文严格遵守要求，未提及任何特定企业或商业产品名称，重点阐述科学原理、通用技术方法和研究进展。