亲和力实验核心技术：BLI与SPR原理与应用详解
在分子互作研究领域，生物膜干涉技术（BLI）与表面等离子体共振技术（SPR）因其无需标记、实时监测、提供完整动力学参数的特点，已成为测定生物分子间相互作用亲和力的金标准。以下为全面解析与技术指南：
一、核心原理剖析
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生物膜干涉技术（Bio-Layer Interferometry, BLI）
- 基础原理： 激光束照射传感器尖端（通常为光纤探针），部分光束在传感器-溶液界面反射，另一部分在生物膜层（固定了配体的基质）内反射。两束反射光发生干涉。
- 信号来源： 分子结合/解离改变传感器表面生物膜厚度或光学密度，导致干涉光波谱发生位移（波长或强度变化）。位移量与结合物质的质量严格成正比。
- 关键特点： 浸入式检测（探针浸入样品孔），样品消耗量较小，仪器相对简单，易于实现高通量筛选。
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表面等离子体共振技术（Surface Plasmon Resonance, SPR）
- 基础原理： 芯片基底（通常是玻璃）上覆盖一层薄金膜。入射光在特定角度（共振角）照射金膜下表面，引发金膜内自由电子产生集体振荡（表面等离子体）。
- 信号来源： 分子结合/解离改变金膜表面附近溶液的折射率。折射率变化导致激发表面等离子体所需的共振角发生偏移。偏移量与结合物质的质量成正比。
- 关键特点： 微流控检测（样品流经固定配体的芯片表面），流体控制精确度高，检测灵敏度通常极高。
二、标准实验流程
通用核心步骤
- 配体固定化： 将目标分子（配体，如受体、抗原、靶蛋白）固定在传感器表面（BLI探针或SPR芯片）。
- 基线平衡： 使用运行缓冲液流过传感器表面，建立稳定基线。
- 结合阶段： 将含有分析物（如抗体、药物、配体）的溶液引入体系，实时监测结合过程引起的信号变化。
- 解离阶段： 切换回运行缓冲液，洗去未结合及弱结合的分子，实时监测解离过程引起的信号变化。
- 再生（选择性）： 使用温和再生液短暂处理传感器表面，去除残留结合物，使表面恢复初始状态（适用于可逆结合）。BLI可直接将探针浸入再生液孔。
关键实验设计考量
- 固定化策略： 选择捕获法（如His标签-抗His抗体、Protein A/G/L捕获抗体Fc段）或直接共价偶联（如氨基、巯基偶联），力求配体活性高、稳定性好、非特异性结合低。
- 缓冲液匹配： 所有溶液（样品、运行缓冲液、再生液）需严格匹配pH、离子强度、缓冲成分、添加剂（如表面活性剂减少非特异吸附）。
- 浓度梯度： 分析物浓度需覆盖合适范围（通常KD值的0.1倍至10倍），梯度设置（如2倍稀释）是获取准确动力学参数的基础。
- 对照设置： 空白参考通道（无配体）、同型对照、缓冲液注射对照必不可少，用于扣除背景漂移及非特异性信号。
三、核心输出参数与解读
通过实时传感图（传感单位RU或nm随时间变化曲线），拟合动力学模型（常用1:1 Langmuir结合模型），可获得：
- 结合速率常数 (ka)： 描述分子相互结合的快慢（单位 M⁻¹s⁻¹）。值越大，结合越快。
- 解离速率常数 (kd)： 描述结合复合物解离的快慢（单位 s⁻¹）。值越大，解离越快。
- 平衡解离常数 (KD)： KD = kd / ka（单位 M）。亲和力的核心指标。KD值越小，亲和力越高（分子间结合越紧密）。
- 结合响应值 (Rmax)： 达到饱和结合时的理论最大响应值，用于验证固定化配体活性及结合化学计量比。
四、核心应用场景
- 抗体药物研发：
- 筛选高亲和力候选抗体
- 测定抗体对抗原的亲和力（KD）、结合/解离速率（ka/kd）
- 评估抗体交叉反应性
- 检测抗体与Fc受体（FcγR、FcRn）的相互作用
- 蛋白质-蛋白质相互作用：
- 定量表征信号通路中蛋白复合物的形成与解离
- 研究酶与底物/抑制剂的作用机制
- 分析受体-配体结合的动力学特征
- 小分子药物发现：
- 筛选和验证靶点蛋白与小分子化合物（碎片、苗头化合物、先导物）的结合活性及亲和力
- 测定竞争性结合（评估化合物竞争活性）
- 核酸相互作用：
- 研究DNA/RNA结合蛋白、转录因子、核酸适配体的相互作用
- 分析核酸-核酸杂交动力学
- 疫苗开发：
- 评估疫苗免疫原产生的抗体对抗原的亲和力成熟度。
- 生物标志物验证：
- 定量检测生物样本中目标分子的浓度（通过亲和力已知的配体捕获）。
五、BLI与SPR技术优势对比
| 特征 | BLI (生物膜干涉技术) | SPR (表面等离子体共振技术) |
|---|---|---|
| 检测原理 | 生物膜干涉 | 表面等离子体共振 |
| 检测方式 | 浸入式 (Dip-and-Read) | 微流控 (Flow Cell) |
| 样品消耗 | 相对较低 (微升级别) | 相对较高 (取决于流速和接触时间) |
| 通量潜力 | 高 (通常支持8-16通道甚至更高并行检测) | 中等 (典型仪器有1-4个流动池或检测通道) |
| 灵敏度 | 良好 | 通常更高 |
| 流体动力学 | 较弱 (依赖扩散结合) | 精确可控 (可控流动)，利于结合动力学研究 |
| 仪器复杂度 | 相对简单 | 相对复杂 |
| 维护成本 | 较低 (探针为耗材) | 较高 (精密微流控系统，金芯片为耗材) |
| 再生便利性 | 非常方便 (直接浸入再生液孔) | 方便 (在流动池内注入再生液) |
| 应用侧重 | 高通量筛选、快速结合验证、浓度测定 | 高精度动力学分析、低分子量互作、复杂体系研究 |
六、前沿发展与展望
- 多重相互作用分析： 开发能在单次实验中同时检测多种相互作用的新一代仪器。
- 小分子检测灵敏度提升： 改进传感表面化学与检测算法，优化小分子（<200 Da）相互作用的灵敏度和动力学分辨率。
- 高通量自动化整合： 与自动化液体处理工作站深度整合，实现大规模文库筛选的全流程无人化操作。
- 数据分析智能化： 应用机器学习与人工智能技术，提升复杂传感图谱拟合精度及相互作用模型识别能力。
- 体内样本质控应用： 探索在复杂生物体液（血清、裂解液）中直接获取特异性动力学数据的可行性。
结论
BLI与SPR技术以其实时、无标记、定量提供动力学和热力学参数的核心优势，深刻改变了分子互作研究领域。理解其原理差异、掌握标准化实验流程、严谨进行数据处理与分析，是获得可靠亲和力数据的前提。随着技术进步与应用场景的不断拓展，这两大平台将持续为生命科学研究和药物开发提供不可或缺的原动力。
关键参考文献领域：
- Rich, R. L., & Myszka, D. G. (2007). Higher-throughput, label-free, real-time molecular interaction analysis. Analytical Biochemistry.
- Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., & Pons, J. (2008). Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet. Analytical Biochemistry.
- Nature Methods 技术综述系列常刊载SPR/BLI技术评估及方法学进展。
- 《Protein-Ligand Interactions: Methods and Applications》等专业工具书提供详细实验方案。