多糖分子量分布检测

发布时间：2025-06-28 09:18:07 阅读量：2 作者：生物检测中心

多糖分子量及其分布检测技术详解

多糖作为广泛存在于动植物、微生物中的重要生物大分子，其分子量大小及分布特征直接决定了其理化性质（如溶解度、粘度、流变性）和生物活性（如免疫调节、抗肿瘤、降血糖等）。精确表征多糖分子量及其分布，是新药研发、食品科学、材料工业等领域质量控制与结构功能研究的关键环节。

一、核心检测原理：体积排阻色谱（SEC）主导分离

体积排阻色谱（Size Exclusion Chromatography, SEC)，亦称凝胶渗透色谱（Gel Permeation Chromatography, GPC），是当前测定多糖分子量及其分布最核心、应用最广泛的技术。其核心工作原理基于分子在色谱柱中的流体力学体积差异进行分离：

  1. 固定相： 使用具有特定孔径范围、亲水性的多孔凝胶或聚合物填料（如交联葡聚糖、琼脂糖或亲水性修饰的硅胶）。
  2. 分离机制： 不同大小的多糖分子在通过色谱柱时，分子量大的分子因其较大的流体力学体积，难以进入填料颗粒内部孔洞，流经路径较短，首先被洗脱出色谱柱；分子量小的分子则更容易进入孔洞内部，经历更长的路径，较晚被洗脱出来。因此，洗脱顺序遵循分子量从大到小的次序。
  3. 洗脱液： 根据多糖的性质选择合适的流动相（常用水相缓冲盐溶液，如硝酸钠、磷酸盐缓冲液，有时需添加少量有机溶剂如乙腈以改善分离效果或防止非特异性吸附）。
  4. 检测器联用： SEC本身仅能提供按分子尺寸大小的分离信息。要获得绝对的分子量信息及其分布，必须将SEC柱与能够响应浓度并测量分子量的检测器联用。
 

二、关键检测器技术与联用方案

  1. 示差折光检测器（RID）：

    • 原理： 连续测量洗脱液与纯流动相之间折光指数的差异，该差异与洗脱组分的浓度成正比。
    • 优点： 通用性强，对绝大多数溶解的多糖都有响应，灵敏度相对稳定。
    • 局限性： 仅能提供浓度信号，无法直接给出分子量信息；对温度、压力和流速变化敏感；灵敏度相对较低（尤其对小分子量组分）。

  2. 多角度激光光散射检测器（MALLS）：

    • 原理： 激光照射在洗脱组分上产生散射光。通过检测多个角度（通常≥7个）的散射光强，结合浓度检测器（如RID）提供的浓度信息，根据光散射理论（瑞利-德拜方程），即可无需标准品直接计算出溶液中大分子的绝对分子量（Mw）、均方根旋转半径（Rg）等信息。
    • 优点： 提供绝对分子量（无需依赖标准曲线）；可同时获得分子尺寸（Rg）信息；尤其擅长检测高分子量组分、支链或聚集结构（Rg/Mw关系可指示分子构象）。
    • 局限性： 仪器昂贵；操作和数据处理相对复杂；对样品洁净度要求极高（微小颗粒或灰尘会产生强散射干扰）；对极低分子量组分（<~10，000 Da）灵敏度有限。

  3. 粘度检测器（Viscometer）：

    • 原理： 串联两个或多个毛细管桥式压力传感器，测量溶液流经毛细管时产生的压差（与粘度成正比）。结合浓度检测器信号，根据马克-豪温克方程（[η]=KM^α）可计算特性粘度[η]和分子量。
    • 优点： 提供分子流体力学体积的直接信息（特性粘度[η]）；可计算分子在溶液中的构象参数（如马克-豪温克常数α）；有助于判断支化度（支链分子的[η]通常低于相同分子量的线形分子）。
    • 局限性： 本身不能直接给出绝对分子量，需结合已知K和α值的标准品或联用光散射检测器才能计算分子量；对低浓度样品灵敏度可能受限。

  4. 紫外/可见光吸收检测器（UV/Vis）：

    • 原理： 检测洗脱组分在某特定波长下的吸光度。
    • 优点： 灵敏度高（尤其对含生色团的多糖或其衍生物）；选择性好（可用于特定基团检测）。
    • 局限性： 通用性差，大多数中性多糖在紫外区无吸收或吸收很弱；主要用于含糖醛酸（在~210nm左右有吸收）、苯胺基衍生化多糖（如PMP衍生物，~250nm）或蛋白多糖等。
 

主流联用方案：

  • SEC-RID： 最基础配置，需依赖标准品校准曲线才能得到分子量分布信息。
  • SEC-RID-MALLS： 金标准组合。RID提供浓度，MALLS提供绝对分子量和尺寸信息，无需标准品即可获得完整的分子量分布（Mn, Mw, Mz, PDI）和分子构象信息，适用于复杂多糖体系。
  • SEC-RID-Viscometer： RID提供浓度，粘度计提供[η]，可用于研究多糖构象（计算α值）或作为MALLS的补充验证。
  • SEC-UV/Vis： 适用于具有特定紫外吸收的多糖或其衍生物，常与其他检测器联用以增加选择性或灵敏度。
  • 四检测器联用 (SEC-RID-MALLS-Viscometer)： 提供最全面的信息集合（浓度、绝对分子量、Rg、[η]），用于深入表征多糖结构和构象。
 

三、标准品与校准曲线法

  • 重要性： 对于无法使用MALLS或不具备该设备的实验室，使用已知分子量的标准品建立校准曲线是SEC-RID测定分子量分布的主要方法。
  • 标准品选择：
    • 窄分布标准品： 分子量分布尽可能窄（PDI<1.1）的标准多糖。
    • 结构相似性： 理想情况下，标准品应与待测多糖具有相似的化学结构和构象（如线状葡聚糖用于类似结构的葡聚糖、支链淀粉用于支链多糖等）。
    • 覆盖范围： 标准品分子量范围应覆盖预期样品分子量范围。
  • 方法：
    1. 使用一系列不同分子量的窄分布标准品分别进样分析，记录其保留时间（或保留体积）。
    2. 以标准品分子量的对数值（log M）对其保留时间（或保留体积）作图，得到校准曲线（通常拟合为三次多项式或线性关系）。
    3. 在完全相同的色谱条件下分析待测样品。
    4. 根据样品的保留时间，利用校准曲线插值计算其表观分子量。
  • 局限性：
    • 结构依赖性： 校准曲线高度依赖于标准品与被测物的化学结构和构象相似性。若两者差异大（如标准品为线形葡聚糖，样品为支链甘露聚糖），则计算结果误差较大。
    • 分子量外推： 样品分子量超出标准品范围时，外推结果不可靠。
    • 获得的是相对分子量： 结果依赖于标准品的标称值。
    • 无法检测构象变化： 不能提供Rg或支化信息。
 

四、样品前处理关键要点

  1. 溶解：
    • 选择合适溶剂（多为水、缓冲盐溶液或含盐的DMSO），确保多糖完全溶解成真溶液。
    • 加热、超声、搅拌、调节pH等方法可能有助于溶解。
    • 避免使用强酸强碱以防降解。
  2. 浓度优化：
    • 浓度过高会导致色谱峰展宽、柱超载、粘度效应干扰分离和光散射测量。
    • 浓度过低则降低检测灵敏度。
    • 需根据多糖分子量和检测器灵敏度确定最佳进样浓度（通常推荐范围为0.5-5 mg/mL）。
  3. 过滤：
    • 至关重要！ 使用孔径≤0.22 µm（常选用0.1 µm）的亲水性微孔滤膜过滤样品溶液。
    • 目的：去除任何不溶性颗粒、微凝胶或灰尘，防止堵塞色谱柱或检测器（特别是MALLS）。
  4. 避免降解：
    • 溶解和操作过程避免剧烈搅拌、长时间高温加热。
    • 必要时可冷藏储存，并尽快分析。
  5. 去除杂质：
    • 样品中含有的盐分、小分子杂质、蛋白质、核酸等可能干扰检测。需根据具体情况通过透析、超滤、沉淀、离子交换等方法进行纯化。样品溶液应与流动相匹配（溶解所用溶剂成分、离子强度、pH值尽可能接近流动相）。
 

五、典型应用场景与结果呈现

  1. 质量控制：
    • 监控不同批次原料或产品（如透明质酸注射液、肝素类产品、食品级增稠剂）的分子量分布一致性。
    • 确保产品符合药典或行业标准的分子量范围要求。
  2. 结构与功能关系研究：
    • 比较不同来源、不同提取工艺、不同修饰多糖的分子量分布差异。
    • 研究分子量及分布与粘度、凝胶强度、免疫活性、抗氧化活性等的关系。
    • 探究多糖在溶液中的构象（球状、无规线团、棒状等）。
    • 检测多糖的降解程度（如辐射灭菌、酸处理、酶解后分子量变化）。
    • 研究多糖的聚集行为。
  3. 结果呈现：
    • 色谱图： 显示洗脱体积/时间与检测器响应（RI、LS、UV等）的关系。不同分子量组分在不同时间出峰。
    • 微分分子量分布曲线： 以分子量（常取对数坐标）为横坐标，以占总量的百分比为纵坐标（dW/d(logM) vs logM）作图。直观显示样品中不同分子量组分的含量分布情况。峰形宽窄代表分布宽窄。
    • 累积分子量分布曲线： 显示累积重量分数（I%）随分子量（logM）的变化。
    • 数值报告： 关键参数包括：
      • 数均分子量 (Mn)： 所有分子质量的算术平均值。对小分子量组分敏感。
      • 重均分子量 (Mw)： 基于分子质量的加权平均值。对大分子量组分敏感。是表征平均分子量最常用的参数。
      • Z均分子量 (Mz)： 更高阶的加权平均值，对大分子量组分更敏感。
      • 分散度/多分散指数 (PDI, Đ)： Đ = Mw / Mn。数值≥1，越接近1表示分子量分布越均一，数值越大表示分布越宽。
      • (如使用MALLS)： 均方根旋转半径（Rg），特性粘度[η]，马克-豪温克常数α和K等。
    • (如使用校准曲线法)： 明确标明所使用的标准品系列及其分子量范围。
 

六、其他辅助或替代方法简述

  1. 超速离心（Analytical Ultracentrifugation, AUC）：
    • 基于沉降速度（Sedimentation Velocity, SV）或沉降平衡（Sedimentation Equilibrium, SE）原理。
    • 可在接近生理条件下测定分子量（绝对法），提供分子大小、形状、均一性及相互作用信息。
    • 设备昂贵、操作复杂、通量低，常作为光散射的补充或验证手段。
  2. 质谱法（Mass Spectrometry, MS）：
    • 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 (MALDI-TOF MS)： 适用于分子量相对较低（通常<100 kDa）、分布较窄的多糖或寡糖分子量的精确测定。能提供单电荷或多电荷离子峰信息。
    • 电喷雾电离质谱 (ESI-MS)： 同样常用于寡糖和较小分子量多糖的分析，可在液相条件下进行，常与液相色谱联用（LC-MS）。对于高分子量多糖，质谱分辨率下降，谱图复杂。
    • 优点： 高灵敏度，精确分子量（单同位素分辨率），可提供结构片段信息。
    • 局限： 对高分子量多糖分析困难；样品离子化效率受化学结构影响大；定量分析复杂；通常不能直接反映溶液状态下的流体力学体积。
  3. 粘度法：
    • 通过测量纯溶剂和不同浓度样品溶液的粘度，外推得到特性粘度[η]。
    • 结合马克-豪温克方程（[η]=KM^α）估算平均分子量（需已知K和α值）。
    • 仪器简单，成本低。
    • 局限： 只能得到一个平均分子量（粘均分子量Mη），无法获得分布信息；对K和α值的依赖性很强（结构敏感性）；样品需量较大且浓度需精准控制。
 

七、总结与展望

SEC联用多检测器（尤其是MALLS+RID）是目前精确、全面表征多糖分子量及其分布的金标准技术，能提供绝对分子量、分布宽度、分子尺寸及构象等重要信息。校准曲线法（SEC-RID）在标准品匹配良好的情况下，仍是许多实验室常规分析的重要手段。

准确的结果高度依赖于严格的样品前处理（完全溶解、精准过滤） 和恰当的色谱条件优化（色谱柱选择、流动相、流速、温度）。选择何种检测器和方案应基于研究目的、样品特性、可用资源和精度要求。

未来发展趋势包括：更高性能色谱柱的开发（分辨率、稳定性、兼容性）；更灵敏、更稳定的光散射和粘度检测器；自动化样品制备和分析流程；更强大的数据处理软件用于复杂多糖体系的分析；以及与其他技术（如质谱、核磁共振）的更深度联用，以期在分子量和分布信息之外，获得更丰富的化学结构细节。