多糖的提取和分离纯化

多糖作为一类重要的生物大分子，广泛存在于动植物及微生物中，具有免疫调节、抗肿瘤、降血糖、抗氧化等多种生物活性。要深入研究其结构与功能，获得高纯度、结构完整的样品是基础。以下是多糖提取与分离纯化的主要流程和技术要点：

一、原料预处理

干燥与粉碎： 新鲜或冷冻原料常需干燥（如烘干、冻干）并粉碎，增加比表面积，利于溶剂渗透。
脱脂： 含脂质较多的原料（如种子、微生物菌体）需先用有机溶剂（如石油醚、乙醚、丙酮）回流提取去除脂溶性杂质。
脱色素： 对于有色原料（如藻类、部分植物），可用活性炭吸附或乙醇洗涤等方法脱色。

二、提取
目标是最大限度地将多糖从细胞基质或组织中溶解出来，同时尽量减少降解。常用方法有：

热水浸提法：
- 原理： 利用高温增加多糖溶解度，破坏细胞结构。
- 操作： 原料粉末在一定比例的蒸馏水中，于特定温度（常在80-100°C）下搅拌浸提数小时。可重复提取多次。
- 优点： 设备简单、成本低、安全性高，适用于大多数水溶性中性或酸性多糖。
- 缺点： 高温可能导致部分热敏性多糖降解；提取液中杂质（蛋白质、色素、无机盐等）含量高；对某些紧密结合的多糖提取效率低。
酸/碱浸提法：
- 原理： 利用酸或碱改变溶液pH值，促使水溶性差或与细胞壁紧密结合的多糖（如半纤维素、果胶、某些微生物胞外多糖）溶解。
- 操作：
  - 酸提： 常用稀酸（如0.1-0.5 M HCl, H2SO4, TFA）在较低温度（常室温或<60°C）下提取，适用于酸稳定性多糖。
  - 碱提： 常用稀碱（如0.1-1 M NaOH）在低温（常<25°C）或较低温度下提取，适用于碱性条件下稳定的多糖（如真菌β-葡聚糖）。低温有助于减少多糖在碱中的降解（如脱乙酰化、β-消除）。
- 优点： 可有效提取热水难溶的多糖。
- 缺点： 条件控制严格，易导致多糖降解、结构改变（如脱乙酰基、糖苷键断裂）；引入大量盐分，后续处理复杂。
酶辅助提取法：
- 原理： 利用特定酶（如纤维素酶、果胶酶、蛋白酶）破坏细胞壁或降解连接多糖的基质，提高多糖溶出率和选择性。
- 操作： 在适宜的温度和pH条件下，用单一酶或复合酶处理原料或其水提残渣。
- 优点： 条件温和、专一性强、提取效率高、杂质少、环境友好，能更好地保持多糖天然结构。
- 缺点： 酶成本较高；需要优化酶种类、用量、作用时间等条件；酶本身可能成为杂质。
超声波/微波辅助提取法：
- 原理： 利用超声波的空化效应或微波的电磁热效应，剧烈扰动细胞，加速溶剂渗透和物质扩散。
- 操作： 通常在热水或其他溶剂提取时辅以超声波或微波处理（控制功率和时间）。
- 优点： 显著缩短提取时间，提高提取效率，降低能耗。
- 缺点： 需专用设备；长时间或高功率处理可能破坏多糖结构（尤其是超声波）；微波可能导致局部过热。

三、初步分离（除杂质与浓缩）
粗提液成分复杂，需初步去除蛋白质、色素、小分子杂质并浓缩。

除蛋白: 常用方法有：
- Sevag法： 向多糖溶液中加入氯仿:正丁醇（4:1或5:1）混合液，剧烈振荡，离心弃去变性蛋白层。重复多次。经典有效，但有机溶剂用量大且有毒性。
- 三氯乙酸/过氯酸法 (TCA/PCA)： 加入一定浓度的TCA或PCA溶液，低温离心沉淀蛋白质。效率高，但强酸可能引起某些酸性多糖沉淀或降解。
- 酶解法： 加入蛋白酶（如胃蛋白酶、胰蛋白酶）水解蛋白质。条件温和，杂质引入少，但成本较高，需去除残留酶。
- 等电点沉淀法： 调节pH至蛋白质等电点使其沉淀。适用于等电点明确的杂质蛋白。
脱盐与脱小分子杂质:
- 透析： 利用半透膜（如纤维素膜）的分子筛作用，在流水中透析数天去除无机盐、单糖、寡糖等小分子杂质。操作简单，但耗时长，体积缩小有限。
- 超滤： 利用不同截留分子量的超滤膜，在压力驱动下分离不同大小的分子。可同时实现浓缩（去除水）和脱盐/脱小分子杂质（去除小于膜孔径的分子）。速度快，效率高，是常用手段。
- 凝胶过滤层析 (GFC)： 也可用于脱盐，但通常放在纯化步骤。
脱色素： 除预处理外，提取液中色素可用活性炭吸附、过氧化氢氧化、大孔吸附树脂吸附等方法去除。
浓缩： 常用旋转蒸发仪减压浓缩、真空冷冻干燥（冻干）、超滤浓缩等方法，将溶液体积减小。

四、纯化
初步分离后的样品仍可能是多糖混合物，需进一步分离纯化以获得均一多糖组分。

沉淀法：
- 乙醇/丙酮沉淀： 向多糖浓缩液中加入不同体积的乙醇或丙酮（最终浓度常为60%-80%），低温静置或离心收集沉淀。是最常用且有效的多糖沉淀方法。可通过改变醇沉浓度进行初步分级沉淀（如先用40%醇沉去除杂质，再用70%-80%醇沉收集目标多糖）。沉淀需用无水乙醇、丙酮洗涤脱水，真空干燥。
- 季铵盐沉淀 (CTAB等)： 酸性多糖在低离子强度下可与季铵盐（如十六烷基三甲基溴化铵CTAB）形成沉淀。通过调节pH和离子强度可选择性沉淀不同电荷密度的酸性多糖。沉淀物需溶解于高浓度盐溶液（如NaCl）中，再透析除去盐和CTAB。
- 金属络合物沉淀 (如铜盐、钡盐)： 某些特定结构的糖能与金属离子形成络合物沉淀（如甘露聚糖与Cu²⁺形成的Fehling试剂沉淀）。
柱层析法： 是获得高纯度均一多糖组分的关键技术。
- 离子交换层析 (IEC)：
  - 原理： 基于多糖所带电荷差异进行分离。常用载体如DEAE-纤维素（弱阴离子交换剂）、CM-纤维素（弱阳离子交换剂）、DEAE-琼脂糖凝胶（如DEAE-Sepharose CL-6B）等。
  - 操作： 多糖样品上样到平衡好的离子交换柱，先用低离子强度缓冲液（如Tris-HCl, 磷酸盐）洗脱中性多糖或弱吸附组分，再用梯度或阶跃增加的盐溶液（如NaCl梯度）洗脱带不同电荷密度的酸性或碱性多糖。洗脱液分部收集。
  - 优点： 分辨率高，是分离不同电荷多糖的首选方法。
- 凝胶过滤层析/尺寸排阻层析 (GFC/SEC)：
  - 原理： 基于多糖分子尺寸（流体力学体积）差异进行分离。常用介质如琼脂糖凝胶（Sepharose CL系列）、葡聚糖凝胶（Sephadex G系列）、聚丙烯酰胺凝胶（Bio-Gel P系列）等。
  - 操作： 多糖样品上样到平衡好的凝胶柱，用单一缓冲液（常含少量盐如NaCl以防非特异性吸附）进行等度洗脱。分子量大的先流出，分子量小的后流出。洗脱液分部收集。
  - 优点： 条件温和，可用于脱盐、测定分子量分布以及分离不同分子量的多糖组分。
- 亲和层析：
  - 原理： 利用多糖与固定化配基（如凝集素Lectin）的特异性生物亲和力进行分离。例如，Con A-Sepharose柱可特异性结合含α-甘露糖或α-葡萄糖的多糖。
  - 优点： 特异性强，纯化效率高。
  - 缺点： 配基成本高，应用范围受限于配基种类。
- 制备型高效液相色谱/快速蛋白液相色谱 (HPLC/FPLC)： 使用基于IEC、SEC或反相原理的HPLC/FPLC柱进行分离，自动化程度高，分辨率高，速度快，适用于微量样品的精细纯化。

五、脱盐、浓缩与干燥
纯化后的组分常含有盐分（特别是IEC洗脱组分），需再次透析或超滤脱盐。最终溶液可冻干或真空干燥得到白色絮状或粉末状的多糖纯品。

六、纯度鉴定与结构分析
纯化得到的多糖样品需进行初步鉴定：

纯度鉴定： 常用方法有高效凝胶渗透色谱（HPGPC，单一对称峰）、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE，单一染色条带）等。
分子量测定： HPGPC结合多角度激光光散射（MALLS）和示差折光检测器（RI）是测定多糖绝对分子量及分布的常用方法；也可用粘度法、超速离心沉降法等。
结构分析： 后续还需通过化学分析（如完全酸水解测单糖组成、甲基化分析测糖苷键连接位置）、仪器分析（如红外光谱IR、核磁共振波谱NMR）等手段解析其详细的化学结构（单糖组成、糖苷键类型与连接顺序、构型、分支度等）。

注意事项：

防止降解： 整个流程中（尤其是提取和浓缩环节）要避免高温、强酸强碱长时间作用，以防止多糖降解。
抑制微生物： 操作过程中（特别是浓缩、透析、层析过程）可加入适量防腐剂（如甲苯、叠氮化钠）或保持低温，以防止微生物滋生。
粘度问题： 高浓度多糖溶液粘度极大，影响过滤、离心和层析效率。可通过稀释、加热（热稳定的）、加入适量盐或酶解辅助处理。
样品损失： 多糖易吸附于玻璃、塑料等器皿表面，尤其在低浓度时。可使用硅烷化处理的器皿或加入载体蛋白（如牛血清白蛋白BSA，须在后续步骤去除）。
溶剂安全： 使用有机溶剂（乙醇、丙酮、氯仿等）时需注意通风和防火防爆。

多糖的提取与分离纯化是一个多步骤、多技术的系统工程。研究者需要根据目标多糖的来源、性质（溶解性、分子量、电荷、稳定性等）和研究目的，选择合适的预处理、提取、除杂和纯化方法组合，并优化每一步的操作条件（温度、时间、pH、溶剂浓度、料液比等）。严谨的操作和对细节的关注是获得高质量多糖样品的关键。