多糖的提取和分离纯化
多糖作为一类重要的生物大分子,广泛存在于动植物及微生物中,具有免疫调节、抗肿瘤、降血糖、抗氧化等多种生物活性。要深入研究其结构与功能,获得高纯度、结构完整的样品是基础。以下是多糖提取与分离纯化的主要流程和技术要点:
一、 原料预处理
- 干燥与粉碎: 新鲜或冷冻原料常需干燥(如烘干、冻干)并粉碎,增加比表面积,利于溶剂渗透。
- 脱脂: 含脂质较多的原料(如种子、微生物菌体)需先用有机溶剂(如石油醚、乙醚、丙酮)回流提取去除脂溶性杂质。
- 脱色素: 对于有色原料(如藻类、部分植物),可用活性炭吸附或乙醇洗涤等方法脱色。
二、 提取
目标是最大限度地将多糖从细胞基质或组织中溶解出来,同时尽量减少降解。常用方法有:
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热水浸提法:
- 原理: 利用高温增加多糖溶解度,破坏细胞结构。
- 操作: 原料粉末在一定比例的蒸馏水中,于特定温度(常在80-100°C)下搅拌浸提数小时。可重复提取多次。
- 优点: 设备简单、成本低、安全性高,适用于大多数水溶性中性或酸性多糖。
- 缺点: 高温可能导致部分热敏性多糖降解;提取液中杂质(蛋白质、色素、无机盐等)含量高;对某些紧密结合的多糖提取效率低。
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酸/碱浸提法:
- 原理: 利用酸或碱改变溶液pH值,促使水溶性差或与细胞壁紧密结合的多糖(如半纤维素、果胶、某些微生物胞外多糖)溶解。
- 操作:
- 酸提: 常用稀酸(如0.1-0.5 M HCl, H2SO4, TFA)在较低温度(常室温或<60°C)下提取,适用于酸稳定性多糖。
- 碱提: 常用稀碱(如0.1-1 M NaOH)在低温(常<25°C)或较低温度下提取,适用于碱性条件下稳定的多糖(如真菌β-葡聚糖)。低温有助于减少多糖在碱中的降解(如脱乙酰化、β-消除)。
- 优点: 可有效提取热水难溶的多糖。
- 缺点: 条件控制严格,易导致多糖降解、结构改变(如脱乙酰基、糖苷键断裂);引入大量盐分,后续处理复杂。
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酶辅助提取法:
- 原理: 利用特定酶(如纤维素酶、果胶酶、蛋白酶)破坏细胞壁或降解连接多糖的基质,提高多糖溶出率和选择性。
- 操作: 在适宜的温度和pH条件下,用单一酶或复合酶处理原料或其水提残渣。
- 优点: 条件温和、专一性强、提取效率高、杂质少、环境友好,能更好地保持多糖天然结构。
- 缺点: 酶成本较高;需要优化酶种类、用量、作用时间等条件;酶本身可能成为杂质。
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超声波/微波辅助提取法:
- 原理: 利用超声波的空化效应或微波的电磁热效应,剧烈扰动细胞,加速溶剂渗透和物质扩散。
- 操作: 通常在热水或其他溶剂提取时辅以超声波或微波处理(控制功率和时间)。
- 优点: 显著缩短提取时间,提高提取效率,降低能耗。
- 缺点: 需专用设备;长时间或高功率处理可能破坏多糖结构(尤其是超声波);微波可能导致局部过热。
三、 初步分离(除杂质与浓缩)
粗提液成分复杂,需初步去除蛋白质、色素、小分子杂质并浓缩。
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除蛋白: 常用方法有:
- Sevag法: 向多糖溶液中加入氯仿:正丁醇(4:1或5:1)混合液,剧烈振荡,离心弃去变性蛋白层。重复多次。经典有效,但有机溶剂用量大且有毒性。
- 三氯乙酸/过氯酸法 (TCA/PCA): 加入一定浓度的TCA或PCA溶液,低温离心沉淀蛋白质。效率高,但强酸可能引起某些酸性多糖沉淀或降解。
- 酶解法: 加入蛋白酶(如胃蛋白酶、胰蛋白酶)水解蛋白质。条件温和,杂质引入少,但成本较高,需去除残留酶。
- 等电点沉淀法: 调节pH至蛋白质等电点使其沉淀。适用于等电点明确的杂质蛋白。
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脱盐与脱小分子杂质:
- 透析: 利用半透膜(如纤维素膜)的分子筛作用,在流水中透析数天去除无机盐、单糖、寡糖等小分子杂质。操作简单,但耗时长,体积缩小有限。
- 超滤: 利用不同截留分子量的超滤膜,在压力驱动下分离不同大小的分子。可同时实现浓缩(去除水)和脱盐/脱小分子杂质(去除小于膜孔径的分子)。速度快,效率高,是常用手段。
- 凝胶过滤层析 (GFC): 也可用于脱盐,但通常放在纯化步骤。
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脱色素: 除预处理外,提取液中色素可用活性炭吸附、过氧化氢氧化、大孔吸附树脂吸附等方法去除。
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浓缩: 常用旋转蒸发仪减压浓缩、真空冷冻干燥(冻干)、超滤浓缩等方法,将溶液体积减小。
四、 纯化
初步分离后的样品仍可能是多糖混合物,需进一步分离纯化以获得均一多糖组分。
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沉淀法:
- 乙醇/丙酮沉淀: 向多糖浓缩液中加入不同体积的乙醇或丙酮(最终浓度常为60%-80%),低温静置或离心收集沉淀。是最常用且有效的多糖沉淀方法。可通过改变醇沉浓度进行初步分级沉淀(如先用40%醇沉去除杂质,再用70%-80%醇沉收集目标多糖)。沉淀需用无水乙醇、丙酮洗涤脱水,真空干燥。
- 季铵盐沉淀 (CTAB等): 酸性多糖在低离子强度下可与季铵盐(如十六烷基三甲基溴化铵CTAB)形成沉淀。通过调节pH和离子强度可选择性沉淀不同电荷密度的酸性多糖。沉淀物需溶解于高浓度盐溶液(如NaCl)中,再透析除去盐和CTAB。
- 金属络合物沉淀 (如铜盐、钡盐): 某些特定结构的糖能与金属离子形成络合物沉淀(如甘露聚糖与Cu²⁺形成的Fehling试剂沉淀)。
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柱层析法: 是获得高纯度均一多糖组分的关键技术。
- 离子交换层析 (IEC):
- 原理: 基于多糖所带电荷差异进行分离。常用载体如DEAE-纤维素(弱阴离子交换剂)、CM-纤维素(弱阳离子交换剂)、DEAE-琼脂糖凝胶(如DEAE-Sepharose CL-6B)等。
- 操作: 多糖样品上样到平衡好的离子交换柱,先用低离子强度缓冲液(如Tris-HCl, 磷酸盐)洗脱中性多糖或弱吸附组分,再用梯度或阶跃增加的盐溶液(如NaCl梯度)洗脱带不同电荷密度的酸性或碱性多糖。洗脱液分部收集。
- 优点: 分辨率高,是分离不同电荷多糖的首选方法。
- 凝胶过滤层析/尺寸排阻层析 (GFC/SEC):
- 原理: 基于多糖分子尺寸(流体力学体积)差异进行分离。常用介质如琼脂糖凝胶(Sepharose CL系列)、葡聚糖凝胶(Sephadex G系列)、聚丙烯酰胺凝胶(Bio-Gel P系列)等。
- 操作: 多糖样品上样到平衡好的凝胶柱,用单一缓冲液(常含少量盐如NaCl以防非特异性吸附)进行等度洗脱。分子量大的先流出,分子量小的后流出。洗脱液分部收集。
- 优点: 条件温和,可用于脱盐、测定分子量分布以及分离不同分子量的多糖组分。
- 亲和层析:
- 原理: 利用多糖与固定化配基(如凝集素Lectin)的特异性生物亲和力进行分离。例如,Con A-Sepharose柱可特异性结合含α-甘露糖或α-葡萄糖的多糖。
- 优点: 特异性强,纯化效率高。
- 缺点: 配基成本高,应用范围受限于配基种类。
- 制备型高效液相色谱/快速蛋白液相色谱 (HPLC/FPLC): 使用基于IEC、SEC或反相原理的HPLC/FPLC柱进行分离,自动化程度高,分辨率高,速度快,适用于微量样品的精细纯化。
- 离子交换层析 (IEC):
五、 脱盐、浓缩与干燥
纯化后的组分常含有盐分(特别是IEC洗脱组分),需再次透析或超滤脱盐。最终溶液可冻干或真空干燥得到白色絮状或粉末状的多糖纯品。
六、 纯度鉴定与结构分析
纯化得到的多糖样品需进行初步鉴定:
- 纯度鉴定: 常用方法有高效凝胶渗透色谱(HPGPC,单一对称峰)、聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE,单一染色条带)等。
- 分子量测定: HPGPC结合多角度激光光散射(MALLS)和示差折光检测器(RI)是测定多糖绝对分子量及分布的常用方法;也可用粘度法、超速离心沉降法等。
- 结构分析: 后续还需通过化学分析(如完全酸水解测单糖组成、甲基化分析测糖苷键连接位置)、仪器分析(如红外光谱IR、核磁共振波谱NMR)等手段解析其详细的化学结构(单糖组成、糖苷键类型与连接顺序、构型、分支度等)。
注意事项:
- 防止降解: 整个流程中(尤其是提取和浓缩环节)要避免高温、强酸强碱长时间作用,以防止多糖降解。
- 抑制微生物: 操作过程中(特别是浓缩、透析、层析过程)可加入适量防腐剂(如甲苯、叠氮化钠)或保持低温,以防止微生物滋生。
- 粘度问题: 高浓度多糖溶液粘度极大,影响过滤、离心和层析效率。可通过稀释、加热(热稳定的)、加入适量盐或酶解辅助处理。
- 样品损失: 多糖易吸附于玻璃、塑料等器皿表面,尤其在低浓度时。可使用硅烷化处理的器皿或加入载体蛋白(如牛血清白蛋白BSA,须在后续步骤去除)。
- 溶剂安全: 使用有机溶剂(乙醇、丙酮、氯仿等)时需注意通风和防火防爆。
多糖的提取与分离纯化是一个多步骤、多技术的系统工程。研究者需要根据目标多糖的来源、性质(溶解性、分子量、电荷、稳定性等)和研究目的,选择合适的预处理、提取、除杂和纯化方法组合,并优化每一步的操作条件(温度、时间、pH、溶剂浓度、料液比等)。严谨的操作和对细节的关注是获得高质量多糖样品的关键。