延胡索酸含量检测

发布时间：2025-06-28 08:14:59 阅读量：4 作者：生物检测中心

延胡索酸含量检测方法详解

延胡索酸（富马酸）作为重要的有机酸，在食品（酸味剂、防腐剂）、医药（中间体）及饲料（酸化剂）等领域应用广泛。准确检测其含量对产品质量控制、工艺优化及安全评估至关重要。以下介绍两种常用检测方法及完整操作流程：

一、 高效液相色谱法（HPLC） - 推荐方法

该方法特异性强、灵敏度高、结果准确，适用于复杂基质中延胡索酸的精确测定。

  1. 检测原理：
    样品经适当处理后，通过高压输液泵进入色谱柱进行分离。延胡索酸在特定波长（通常为210 nm）处有强紫外吸收，经紫外检测器检测，其色谱峰面积或峰高与浓度成正比，通过标准曲线进行定量。

  2. 试剂与材料：

    • 延胡索酸标准品： 纯度≥99.0%
    • 磷酸二氢钾（KH₂PO₄）或磷酸（H₃PO₄）： 分析纯，用于配制流动相
    • 磷酸盐缓冲溶液： 如0.02 M KH₂PO₄溶液（可用磷酸调节pH至2.5-3.0）
    • 甲醇或乙腈： 色谱纯
    • 超纯水： 电阻率≥18.2 MΩ·cm（25℃）
    • 流动相： 推荐0.02 M KH₂PO₄溶液（pH≈2.8）或0.1%磷酸水溶液
    • 样品稀释液： 通常为流动相或超纯水
    • 微孔滤膜： 0.22 μm或0.45 μm（水相）
    • 样品瓶： 适合自动进样器

  3. 仪器设备：

    • 高效液相色谱仪（配紫外检测器）
    • 色谱柱：适用于有机酸分析的色谱柱（粒径5 μm，柱长250 mm，内径4.6 mm）
    • pH计
    • 分析天平（精度0.0001 g）
    • 超声波清洗器
    • 微量注射器或自动进样器
    • 容量瓶、移液管等玻璃器皿
    • 滤膜过滤装置

  4. 操作步骤：

    • 标准溶液配制：

      1. 精密称取干燥恒重的延胡索酸标准品适量（约50 mg），置于50 mL容量瓶中。
      2. 用稀释液（如超纯水或流动相）溶解并定容至刻度，摇匀，配制成约1000 μg/mL的标准储备液。
      3. 准确移取储备液适量，用稀释液逐级稀释，配制成一系列浓度的标准工作溶液（如：1, 5, 10, 20, 50, 100 μg/mL）。

    • 样品前处理：

      1. 固体样品： 粉碎混匀，精密称取适量（含延胡索酸约1-10 mg），加入适量稀释液（如50 mL），超声提取20-30分钟，冷却至室温，定容，摇匀。
      2. 液体样品： 充分混匀，精密量取适量，用稀释液稀释至合适浓度范围。
      3. 复杂基质样品： 根据基质特性，可能需增加离心、沉淀蛋白、固相萃取等步骤。
      4. 所有样品溶液均需经0.22 μm或0.45 μm微孔滤膜过滤后供HPLC分析。

    • 色谱条件（示例，需优化）：

      • 色谱柱：常规色谱柱
      • 流动相：0.02 M KH₂PO₄ (pH 2.8) 或 0.1% H₃PO₄水溶液
      • 流速：1.0 mL/min
      • 柱温：25-30℃
      • 检测波长：210 nm
      • 进样量：10-20 μL

    • 系统适用性试验：

      1. 连续进样标准溶液（如100 μg/mL）5-6针，计算延胡索酸峰面积的相对标准偏差（RSD%），应≤2.0%。
      2. 记录延胡索酸的保留时间（tR）和理论塔板数（N），N通常要求>2000。

    • 标准曲线绘制与样品测定：

      1. 依次精密进样不同浓度的标准工作溶液，记录色谱图及延胡索酸峰面积。
      2. 以峰面积（A）为纵坐标，标准溶液浓度（C，μg/mL）为横坐标，绘制标准曲线，进行线性回归，得到回归方程（A = aC + b）及相关系数（R²）。要求R²≥0.999。
      3. 在相同条件下，精密进样处理好的样品溶液，记录色谱图及延胡索酸峰面积（Aₛₐₘ）。
      4. 将Aₛₐₘ代入标准曲线方程，计算样品溶液中延胡索酸的浓度（Cₛₐₘ，μg/mL）。
      5. 根据取样量和稀释倍数，计算原始样品中延胡索酸的含量（mg/g， mg/mL， 或 %）。

  5. 结果计算：

  
 
 
 
样品中延胡索酸含量 = (Cₛₐₘ × V × D) / (W × 1000) × 100% （如需百分比）
 
 
 
* Cₛₐₘ：由标准曲线计算得到的样品溶液中延胡索酸浓度 (μg/mL) * V：样品定容体积 (mL) * D：稀释倍数（如样品溶液需进一步稀释） * W：样品重量或体积 (g 或 mL) * （注：单位需保持一致，最终结果以mg/g, mg/mL或%表示时注意换算）

二、 分光光度法

该方法操作相对简便，仪器普及率高，适用于大批量样品或对精度要求适中的场合。

  1. 检测原理：
    延胡索酸在强酸性条件下加热（或与特定试剂反应），可生成在特定波长（如440-450 nm）处有特征吸收的化合物（如糠醛聚合物），在一定浓度范围内符合朗伯-比尔定律，可通过比色定量。

  2. 试剂与材料：

    • 延胡索酸标准品： 纯度≥99.0%
    • 浓盐酸： 质量分数36-38%，分析纯
    • 超纯水
    • 样品稀释液： 超纯水

  3. 仪器设备：

    • 紫外-可见分光光度计
    • 恒温水浴锅（100℃）
    • 比色管（具塞，10 mL或25 mL）
    • 分析天平（精度0.0001 g）
    • 容量瓶、移液管、吸量管等玻璃器皿

  4. 操作步骤：

    • 标准溶液配制：

      1. 同HPLC法，配制延胡索酸标准储备液（1000 μg/mL）。
      2. 准确移取储备液适量，用超纯水稀释，配制成系列浓度的标准工作溶液（如：0, 10, 20, 40, 60, 80, 100 μg/mL）。

    • 样品前处理：

      1. 固体样品： 粉碎混匀，精密称取适量（含延胡索酸约0.1-1 mg），加入适量水解液（如稀HCl溶液）或直接用水溶解提取，定容（如50 mL），过滤（若浑浊）。
      2. 液体样品： 充分混匀，精密量取适量，用水稀释至合适浓度范围（参考标准曲线范围）。

    • 显色反应与测定：

      1. 精密移取标准工作溶液、样品溶液各1.0 mL，分别置于具塞比色管中。
      2. 向各管中加入浓盐酸4.0 mL，立即盖紧塞子。
      3. 将比色管置于100℃恒温水浴中加热反应35-40分钟（时间需优化确定）。
      4. 取出比色管，迅速冷却至室温（冷水浴）。
      5. 用超纯水将反应液定容至10 mL刻度，摇匀。
      6. 以试剂空白（1.0 mL水 + 4.0 mL浓HCl，同法加热定容）作为参比，在选定波长（如445 nm）处测定标准系列和样品溶液的吸光度（A）。

    • 标准曲线绘制与样品测定：

      1. 以标准溶液的吸光度（A）为纵坐标，浓度（C，μg/mL）为横坐标，绘制标准曲线，进行线性回归，得到回归方程（A = kC + b）及相关系数（R²）。要求R²≥0.990。
      2. 将样品溶液的吸光度（Aₛₐₘ）代入标准曲线方程，计算样品溶液中经显色反应后相当于延胡索酸的浓度（Cₛₐₘ，μg/mL）。
      3. 根据取样量、稀释倍数及显色反应时的取样体积（如1.0 mL），计算原始样品中延胡索酸的含量。

  5. 结果计算：

  
 
 
 
样品中延胡索酸含量 = (Cₛₐₘ × V × D) / (W × Vₐ × 1000) × 100% （如需百分比）
 
 
 
* Cₛₐₘ：由标准曲线计算得到的样品显色液中相当于延胡索酸的浓度 (μg/mL) * V：样品母液定容体积 (mL) * D：样品母液进一步稀释倍数 * W：样品重量 (g) 或体积 (mL)（对应V） * Vₐ：用于显色反应的样品溶液体积 (mL)（如1.0 mL） * （注：单位需保持一致，最终结果以mg/g, mg/mL或%表示时注意换算）

三、 方法学验证与质量控制（通用要求）

无论采用HPLC法还是分光光度法，为保证检测结果的准确可靠，均需进行必要的验证：

  1. 线性范围： 标准曲线应覆盖样品可能的浓度范围，相关系数R²满足要求（HPLC法≥0.999，分光光度法≥0.990）。
  2. 精密度：
    • 重复性： 同一操作者，同一仪器，短时间内对同一样品平行测定6次结果的RSD%需符合要求（HPLC法通常要求≤2%，分光光度法要求≤5%）。
    • 中间精密度： 不同日期、不同操作者或不同仪器对同一样品测定结果的RSD%要求可稍放宽。
  3. 准确度（加标回收率）：
    • 向已知浓度的基质样品（或空白基质）中加入已知量的延胡索酸标准品（低、中、高三个水平）。
    • 按前述方法处理并测定。
    • 计算回收率：回收率(%) = (测得总量 - 本底量) / 加入量 × 100%
    • 要求回收率在满意范围内（通常为90-110%，具体根据行业标准和基质复杂度确定）。
  4. 检出限（LOD）与定量限（LOQ）：
    • LOD： 信号/噪音≥3时对应的浓度（如通过稀释低浓度标液测定）。
    • LOQ： 信号/噪音≥10且在精密度和准确度可接受范围内的最低浓度（如通过稀释低浓度标液测定）。
  5. 专属性/选择性（HPLC法尤为重要）： 在样品基质存在下，延胡索酸峰应与邻近杂质峰达到基线分离（分离度≥1.5）。分光光度法需确认显色反应的特异性。
  6. 耐用性： 考察微小变动（如流动相比例±5%、流速±10%、柱温±5℃、显色温度±2℃、显色时间±5min）对测定结果的影响，应保持稳健性。
  7. 空白试验： 每次实验必须同时进行试剂空白和基质空白（如有）试验，确保无干扰。
 

四、 应用领域

  • 食品工业： 检测果汁、饮料、面包、糖果等食品中作为酸度调节剂或防腐剂的延胡索酸添加量。
  • 饲料工业： 监测酸化剂型饲料添加剂中延胡索酸的实际含量及在饲料成品中的残留量，评估替抗效果。
  • 制药工业： 监控原料药或制剂中延胡索酸（或其盐）的含量，作为中间体的纯度控制。
  • 化工与科研： 生产工艺优化、产品质量检验及合成研究中的含量测定。
 

五、 注意事项与安全

  1. 安全第一：
    • 涉及浓酸（HCl）的操作必须在通风橱内进行，佩戴防护眼镜、实验服及耐酸手套。
    • HPLC流动相使用前超声脱气。
    • 严格按照仪器操作规程使用和维护设备，特别是高压泵和高温水浴。
  2. 标准品与试剂： 使用符合要求的分析纯或色谱纯试剂，标准品需妥善保存，定期核查纯度。
  3. 样品代表性： 样品需充分混匀，取样具有代表性。
  4. 操作规范： 移液、定容、反应时间、温度控制等步骤需严格精确。
  5. 仪器校准： 定期对分析天平、pH计、分光光度计、HPLC系统进行校准。
  6. 数据记录： 完整、清晰、真实地记录所有实验步骤、条件、原始数据和计算结果。
  7. 方法选择： 根据样品特性、检测精度要求、实验室条件及成本，选择合适的方法（HPLC法精度高但成本高，分光光度法简便但可能受干扰）。
 

结论：

延胡索酸含量的准确检测是其相关产品质量控制的核心环节。高效液相色谱法（HPLC）以其高选择性、准确性和精密度成为首选方法，尤其适用于复杂基质或精度要求高的场合。分光光度法则凭借操作简便、成本低廉的优势，在特定应用场景下仍具有实用价值。严格遵循操作规程，实施全面的方法学验证与质量控制措施，是确保检测结果科学、准确、可比的关键。具体方法的选择应根据实际检测需求和实验室资源配置灵活决定。