原核蛋白表达服务中的关键检测项目
原核蛋白表达（主要以大肠杆菌为宿主）是生物技术中快速、低成本获取重组蛋白的常用方法。为确保表达的蛋白符合下游应用（如结构研究、抗体生产、酶活性分析等），需通过一系列严格的检测验证其质量。以下是核心检测项目及其意义：
1. 蛋白表达确认
- 目的：验证目标蛋白是否成功表达。
- 方法：
- SDS-PAGE 电泳：通过分子量比对，初步确认蛋白是否存在及纯度。
- Western Blot：利用特异性抗体检测目标蛋白，验证其身份。
- 标准：电泳条带位置与预期分子量一致，Western Blot显示清晰阳性信号。
2. 蛋白纯度分析
- 目的：评估蛋白样品中目标蛋白的占比，排除宿主蛋白或杂蛋白污染。
- 方法：
- SDS-PAGE 灰度扫描：通过条带灰度值计算目标蛋白占比。
- HPLC（高效液相色谱）：利用色谱峰面积分析纯度，灵敏度高于电泳。
- 标准：纯度需满足下游需求（如结构研究要求>95%，部分应用可接受>80%）。
3. 浓度测定
- 目的：精确量化蛋白浓度，确保后续实验的重复性。
- 方法：
- BCA 法：基于铜离子还原反应，广泛适用于大部分蛋白。
- 紫外分光光度法（A280）：通过色氨酸/酪氨酸吸光度快速测定，需排除核酸干扰。
- 标准：多次重复测定，误差范围≤10%。
4. 生物活性检测
- 目的：验证蛋白是否具有正确构象及功能活性。
- 方法：
- 酶活测定（如荧光底物水解、比色法）。
- 细胞实验（如细胞因子诱导增殖或凋亡）。
- 结合实验（如ELISA检测抗原-抗体结合）。
- 标准：活性需达到理论值或阳性对照的80%以上。
5. 内毒素检测
- 目的：检测样品中细菌内毒素（LPS）含量，避免细胞毒性。
- 方法：
- 鲎试剂法（LAL）：通过凝胶形成或显色反应定量内毒素。
- 标准：根据应用场景设定阈值（如细胞实验要求<1 EU/μg蛋白）。
6. 质谱鉴定
- 目的：精确确认蛋白序列及翻译后修饰（如原核系统中罕见的磷酸化）。
- 方法：
- MALDI-TOF：快速分子量匹配。
- LC-MS/MS：肽段测序，覆盖全序列。
- 标准：肽段覆盖率>90%，关键功能域无突变。
7. 溶解度与稳定性检测
- 目的：评估蛋白在储存或实验条件下的稳定性。
- 方法：
- 离心沉淀法：检测可溶性蛋白比例。
- 温度/pH 梯度实验：观察变性条件。
- 标准：可溶部分占比≥70%，4℃保存1周无明显沉淀。
检测流程示例
- 诱导后菌体裂解 → SDS-PAGE/Western Blot确认表达。
- 纯化（亲和层析等） → HPLC/SDS-PAGE分析纯度。
- 浓缩与透析 → BCA法测浓度，LAL法测内毒素。
- 分装与保存 → 活性检测及稳定性测试。
总结
原核蛋白表达服务的检测体系需兼顾效率与严谨性。通过上述检测可确保蛋白的正确性、纯度、活性及安全性，满足科研、诊断或药物开发的多样化需求。选择服务供应商时，应关注其检测项目的完整性与标准化程度，以降低实验失败风险。
希望这篇文章符合您的需求！如需进一步扩展某个检测环节，请随时告知。