氧化三甲胺及相关代谢物检测

发布时间:2025-06-28 08:01:39 阅读量:2 作者:生物检测中心

氧化三甲胺(TMAO)及相关代谢物检测:技术、应用与意义

一、 引言

氧化三甲胺(Trimethylamine N-oxide, TMAO)是一种存在于人体内的有机小分子化合物,主要由肠道微生物代谢食物中的胆碱、肉碱、甜菜碱等营养物质产生前体三甲胺(TMA),后者经肝脏含黄素单加氧酶(FMOs)氧化生成。近年来,大量研究表明TMAO水平升高与心血管疾病(如动脉粥样硬化、心力衰竭、血栓形成风险增加)、慢性肾脏病(CKD)进展、代谢综合征、2型糖尿病、某些神经系统疾病(如认知功能下降)等多种疾病的发生发展密切相关。因此,准确检测生物样本(主要是血浆或血清,其次是尿液)中的TMAO及其前体代谢物(如TMA、胆碱、肉碱)对于疾病风险预测、机制研究、疗效评估及潜在干预策略开发具有重要意义。

二、 TMAO及相关代谢物的生物学意义

  • TMAO的来源与代谢:
    1. 膳食前体摄入: 富含胆碱(蛋黄、肝脏)、肉碱(红肉、某些能量饮料)、甜菜碱(海鲜、甜菜、菠菜)的食物。
    2. 肠道微生物代谢: 肠道特定菌群(如Anaerosporobacter、Clostridium、Desulfovibrio、Proteus等)将前体转化为三甲胺(TMA)。
    3. 肝脏氧化: 吸收进入门静脉的TMA,在肝脏FMOs(主要是FMO3)作用下被迅速氧化为无气味的TMAO。
    4. 肾脏排泄: TMAO主要通过肾脏从尿液排出体外,少量可经汗液排出。肾功能显著影响其血浆浓度。
  • TMAO的病理生理作用(机制研究关联):
    • 促进动脉粥样硬化: 影响胆固醇代谢(抑制反向胆固醇转运)、促进泡沫细胞形成、激活炎症通路、增强血小板反应性增加血栓风险。
    • 肾脏损伤: 可能通过诱导肾小管上皮细胞损伤、促进肾间质纤维化、加剧氧化应激等途径加速CKD进展。
    • 胰岛素抵抗: 干扰胰岛素信号通路,影响糖代谢。
    • 心力衰竭: 可能影响心肌能量代谢和功能。
    • 神经炎症与认知障碍: 可能通过血脑屏障或影响外周免疫系统间接作用于中枢神经系统。
 

三、 样本采集与处理的关键环节

检测结果的可靠性高度依赖规范的样本采集与处理:

  1. 样本类型:
    • 血浆/血清: 最常用。反映循环系统当前TMAO水平,与疾病风险相关性研究最密切。推荐使用EDTA抗凝血浆,因其抑制酶活性更佳,稳定性优于血清。肝素抗凝血浆也可用,但需确保批间一致性。血清制备需尽快分离,避免血细胞代谢影响。
    • 尿液: 反映一段时间内TMAO的排泄总量,可用于评估整体机体负荷或肾功能对排泄的影响。通常收集24小时尿或晨尿,需记录体积并计算浓度或总量。稳定性相对较好。
  2. 采集与处理:
    • 快速低温处理: 最为关键。 血液样本采集后应立即置于冰上,并在30-60分钟内完成离心(推荐4°C, 3000g, 10-15分钟)分离血浆/血清。
    • 避免反复冻融: 分离后的血浆/血清或尿液应迅速分装到小体积冻存管中,立即置于**-80°C超低温冰箱**冷冻保存。分析前仅解冻所需样本一次。
    • 清洁操作: 使用无污染的容器和耗材。避免使用含TMAO或其前体的消毒剂(如某些季铵盐类)。
    • 饮食控制(研究用): 在严谨的机制或干预研究中,受试者需在采血前禁食特定时间,并可能标准化前几日饮食,以最大程度减少膳食波动带来的影响。
    • 尿液防腐: 24小时尿通常需添加防腐剂(如盐酸或特定商用防腐片剂),并保持低温(4°C)收集。记录总尿量。
 

表:不同生物样本处理要求要点

样本类型 推荐抗凝剂/防腐 离心条件 处理时限 储存条件 稳定性关键点
血浆 EDTA > 肝素 4°C, 3000g, 10-15min ≤60分钟 (冰上) -80°C (分装) 立即冷冻最重要
血清 4°C, 3000g, 10-15min ≤60分钟 (冰上) -80°C (分装) 分离后立即冷冻
尿液 推荐加酸/商用防腐剂 澄清即可 24h尿4°C保存 -80°C (分装) 混匀后分装冷冻

四、 主要检测技术与方法

检测TMAO及其相关代谢物(特别是TMA)的技术不断发展,核心要求是高特异性、高灵敏度和准确性。

  1. 液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS):

    • 原理: 样本经适当前处理后(常用甲醇或乙腈沉淀蛋白),通过高效液相色谱(HPLC/UPLC)将TMAO、TMA及其他可能的干扰物分离,然后进入质谱检测器。质谱采用多重反应监测(MRM)模式,选择特定的母离子和特征性子离子进行定量。
    • 优势:
      • 高特异性: 色谱分离结合分子量和特征碎片离子进行鉴定,能有效区分结构相似物(如甜菜碱、胆碱、肉碱及其衍生物),特别是准确区分TMAO和TMA(TMAO在生理pH下极性极强,保留弱;TMA通常需在碱性条件下分析或衍生化)。
      • 高灵敏度: 可检测低至nmol/L(nM) 水平的TMAO。最低定量限(LOQ)通常在0.1-1 μM范围。
      • 高通量: 可实现自动化,一次进样分析多个样本。
      • 多组分同时分析: 可在一次运行中同时准确定量TMAO、TMA、胆碱、肉碱、甜菜碱等多种相关代谢物。
    • 挑战: 仪器成本高,需要专业操作和维护人员;基质效应可能影响结果(需内标校正,常用氘代标记物如d9-TMAO)。
    • 地位: 目前被广泛认为是检测生物样本中TMAO及相关代谢物的**“金标准”** 方法,尤其适用于临床研究和精准医学应用。
  2. 酶联免疫吸附法(ELISA):

    • 原理: 利用抗原-抗体特异性结合。样本中的TMAO与包被在微孔板上的捕获抗体结合,再与标记有酶(如HRP)的检测抗体结合,加入显色底物后,颜色的深浅与样本中TMAO浓度成正比。
    • 优势:
      • 操作相对简单: 无需复杂仪器,实验室常规设备(酶标仪)即可满足。
      • 通量较高: 适合批量样本筛查。
      • 成本较低: 相对于LC-MS/MS,仪器投入少。
    • 局限:
      • 特异性可能不足: 抗体可能与结构相近的代谢物(如TMA、甜菜碱、二甲胺、胆碱氧化物等)发生交叉反应,导致假阳性或高估。
      • 灵敏度低于LC-MS/MS: 定量下限通常在低μM范围(如~1-5 μM),可能不足以检测某些健康人群或基线水平。
      • 基质效应: 复杂的生物基质(如血浆)可能干扰结合反应,影响准确性。需要严格的样本预处理(稀释)。
    • 应用: 适用于大规模流行病学筛查、临床常规检验(当对绝对精准度要求略低于研究时)或资源有限的环境。解读结果时需谨慎考虑潜在干扰。
  3. 其他方法:

    • 核磁共振波谱法(NMR): 特别是1H-NMR,能在无破坏、无需复杂前处理的情况下同时检测血浆/尿液中包括TMAO在内的多种代谢物。灵敏度(通常>10 μM)低于LC-MS/MS,且设备昂贵、维护成本高。主要用于代谢组学研究。
    • 气相色谱质谱法(GC-MS): 通常需要对TMAO进行衍生化处理(如还原为TMA再进行烷基化衍生),以增加其挥发性。步骤相对繁琐,应用不如LC-MS/MS广泛。
    • 高效液相色谱法(HPLC)结合其他检测器: 如紫外(UV)或蒸发光散射检测器(ELSD)。灵敏度较低,特异性不如MS,对于低浓度TMAO和复杂基质分辨力有限,应用较少。
    • 一步衍生化微量分光光度法: 基于特定显色反应(如与苦味酸反应)。操作相对简单快速,成本最低。但特异性和灵敏度差(仅适合高浓度尿样),极易受多种胺类物质干扰,结果可靠性低,不推荐用于血浆/血清TMAO的准确检测
 

五、 临床应用与结果解读

  1. 疾病风险预测与分层:
    • 心血管疾病: 高水平血浆TMAO(通常>6 μM,也有研究使用更高阈值如10 μM)被视为独立于传统危险因素(血脂、血压、吸烟等)的心血管事件(心肌梗死、卒中、死亡)的预测因子。可用于识别传统风险模型评估为“中危”但实际风险较高的人群。
    • 慢性肾脏病(CKD): TMAO水平随肾功能下降而升高(排泄减少),且高水平TMAO是CKD患者心血管事件和全因死亡的独立预测因子,也与CKD进展速度相关。
  2. 机制研究与药物开发: 基础研究中检测TMAO及其前体是阐明微生物群-宿主共代谢在疾病中作用的关键。也是评估靶向肠道菌群(益生菌、益生元、抗生素)或抑制FMO3酶活性的干预措施疗效的重要生物标志物。
  3. 结果解读注意事项:
    • 肾功能评估: 必须考虑估算肾小球滤过率(eGFR)。 肾功能不全本身就会导致TMAO升高。解读时需结合肾功能状态(如根据eGFR分层分析)。
    • 样本类型与方法差异: 血浆/血清浓度通常比尿液浓度更有临床预测价值(直接反映循环水平)。不同检测方法(尤其是ELISA vs LC-MS/MS)的结果可能存在差异,不同实验室的参考范围也可能不同。比较结果应基于相同样本类型和检测方法。
    • 临界值: 目前尚无国际统一的诊断或风险分级临界值。研究中使用的高低风险切割点多基于特定人群的统计学分布(如四分位数、百分位数)或ROC曲线分析确定。报告结果时应参考实验室提供的参考范围和/或相关文献阈值(注明出处)。
    • 膳食影响: TMAO水平短期内受膳食(尤其是富含前体的食物如红肉、蛋黄、海鲜)影响显著。解读单次检测结果需考虑近期饮食史。在评估个体长期风险时,可能需要多次检测取其平均值。
    • 药物影响: 某些药物可能影响肠道菌群或FMO3活性(如广谱抗生素降低TMAO)。
    • 综合评估: TMAO是一个新兴的风险标志物,不应孤立地解读,应结合传统风险因素(血脂、血压、血糖、吸烟史等)和临床状况进行综合判断。
 

六、 前景与挑战

  • 标准化: 当前迫切需要建立生物样本采集、储存、前处理和检测方法的国际标准化方案,特别是对LC-MS/MS方法(色谱条件、内标选择、质谱参数等),以实现不同实验室间结果的可比性。
  • 即时检测(POCT): 开发现场快速、简便、可靠的检测方法(如基于微流控/生物传感器的设备)对临床即时风险筛查具有重要意义。
  • 动态监测: 探索TMAO在个体内短期(如餐后)和长期(如干预治疗前后)的变化模式及其临床意义。
  • 精准干预: 基于TMAO水平的精准分型,指导个体化干预(如膳食调整、益生菌/元、靶向菌群或酶活性的新药),并监测干预效果。
  • 微生物组关联: 深入研究产生TMA的关键菌种及其功能基因,开发基于菌群特征的预测模型。
 

七、 总结

氧化三甲胺(TMAO)作为肠道微生物-宿主共代谢的关键产物,已成为多种慢性疾病(尤其是心血管和肾脏疾病)的重要风险标志物和潜在治疗靶点。液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS) 凭借其卓越的特异性和灵敏度,是检测生物样本(血浆/血清、尿液)中TMAO及相关代谢物(如TMA)的金标准方法。酶联免疫吸附法(ELISA)可用于大规模筛查,但需注意其潜在的交叉反应性问题。样本的规范化采集与处理(特别是快速低温分离并在-80°C冷冻保存)是保证检测结果准确可靠的前提。临床解读TMAO水平时,必须结合肾功能(eGFR)、检测方法、样本类型、近期饮食及药物情况等进行综合评估。未来研究的重点在于方法标准化、机制深入探索、即时检测技术开发以及基于TMAO的精准干预策略验证与应用。TMAO检测为理解肠道菌群在人类健康与疾病中的作用开辟了新视角,具有广阔的临床应用和研究前景。