磷酸烯醇丙酮酸检测 - 中析研究所生物检测中心

磷酸烯醇丙酮酸（PEP）检测：方法、应用与意义

磷酸烯醇丙酮酸（PEP）是细胞能量代谢的核心分子，位于糖酵解途径末端，直接参与ATP生成与糖异生过程。其浓度变化是细胞能量状态、糖代谢通量和多种病理状态的关键指示剂。现对PEP检测技术进行全面解析：

一、 PEP的生物学重要性

糖酵解关键节点： 在丙酮酸激酶催化下生成丙酮酸，产生ATP。
糖异生前体物质： 经磷酸烯醇丙酮酸羧激酶催化生成草酰乙酸，开启葡萄糖合成。
细菌磷酸转移酶系统底物： 参与糖分转运与磷酸化。
代谢调控枢纽： 浓度反映能量供需平衡，影响多种代谢途径通量。

二、 PEP检测核心方法学详解

酶学分光光度法（经典金标准）
- 原理： 级联酶促反应将PEP定量转化为NADH（或NADPH），通过340nm吸光度变化检测。
- 常用反应体系：
  - 丙酮酸激酶-乳酸脱氢酶（PK-LDH）法：

PEP + ADP → (PK) → 丙酮酸 + ATP 丙酮酸 + NADH + H⁺ → (LDH) → 乳酸 + NAD⁺

监测NADH在340nm处的吸光度下降，下降值与PEP浓度成正比。 * **烯醇酶-丙酮酸激酶-乳酸脱氢酶法：** 适用于含2-磷酸甘油酸样品（需先转化）。 * **特点：** 灵敏度高（可达μM级）、特异性好、操作相对简便、成本较低。适用于血浆、血清、组织匀浆液、细胞提取液等样本。

2. 酶联分析法（高通量、自动化）
* 原理： 基于酶促反应偶联显色或荧光产物生成。
* 常见策略：
* 丙酮酸激酶-丙酮酸氧化酶-过氧化物酶（PK-POD）显色法：

PEP + ADP → (PK) → 丙酮酸 + ATP 丙酮酸 + O₂ + PO₄³⁻ → (丙酮酸氧化酶) → 乙酰磷酸 + CO₂ + H₂O₂ H₂O₂ + 显色底物（如TMB、ABTS）→ (POD) → 有色产物

通过比色法测定有色产物吸光度（如450nm或620nm）。 * **荧光法：** 常利用NADH的固有荧光（激发340nm，发射460nm）或使用荧光染料监测H₂O₂生成。 * **特点：** 通量高、易于自动化、灵敏度良好，适合临床大批量样本筛查或细胞生物学研究。

3. 色谱技术（高分辨率、多组分分析）
* 高效液相色谱（HPLC）：
* 离子交换色谱： 分离糖酵解中间体（含PEP）。
* 反相色谱（RP-HPLC）： 通常需衍生化（如与苯肼反应生成腙）以提高检测灵敏度（紫外或荧光检测）。
* 液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）：
* 原理： HPLC分离后，通过质谱进行高灵敏度、高特异性定量。
* 优势： 无需衍生化、灵敏度极高（可达nM甚至pM级）、可同时定量多种代谢物（代谢组学）、抗基质干扰能力强。
* 应用： 已成为复杂生物样本（血液、组织、单细胞提取物）中PEP准确定量的首选方法，尤其在科研领域。

三、 PEP检测的关键临床应用与意义

遗传性代谢疾病诊断与监测：
- 丙酮酸激酶缺乏症： 红细胞PEP显著升高是该病标志（PK活性下降→PEP堆积→ATP生成障碍→溶血性贫血）。PEP检测是核心辅助诊断指标。
- 磷酸烯醇丙酮酸羧激酶（PEPCK）缺乏症： 罕见，影响糖异生和TCA循环回补，可能导致低血糖、乳酸酸中毒、肝损伤。肝组织或成纤维细胞中PEPCK活性及PEP水平分析有助诊断。
- 其他糖酵解酶缺乏症评估： 上下游酶（如己糖激酶、磷酸果糖激酶）缺陷可能间接影响PEP水平。
糖代谢异常研究：
- 糖尿病研究： 评估肝脏糖异生活性（PEP是限速步骤底物）。
- 肿瘤代谢重编程（Warburg效应）： 癌细胞依赖糖酵解供能，检测PEP及其上下游代谢物变化对于阐明代谢异常机制至关重要。
微生物代谢研究：
- 检测细菌中PEP水平及磷酸转移酶系统（PTS）活性，了解其糖利用能力和代谢调控。
细胞能量状态评估：
- PEP水平是反映细胞ATP生成潜力（尤其在应激状态下）的间接指标。

四、样本处理与检测注意事项

样品采集： 血液样本（肝素/EDTA抗凝）、组织样本（液氮速冻）、细胞样本（迅速淬灭代谢）需规范采集。
前处理： 立即处理或超低温保存。多数方法需制备去蛋白上清液（常用高氯酸、甲醇/乙腈沉淀法）。保持低温操作防止酶降解。
方法选择： 依据灵敏度需求、通量、特异性、成本及样本类型选择（科研优先LC-MS/MS；临床筛查可选酶联法）。
质量控制： 严格设置空白、标准品、质控品（含已知浓度PEP）。标准曲线线性范围需覆盖预期样本浓度。注意内源性干扰物（如样品中丙酮酸、ADP/ATP）。

五、方法学比较与发展趋势

方法	灵敏度	特异性	通量	多组分分析	主要优点	主要局限
酶学比色法	中-高	高	中	否	成本低、设备普及、特异性好	易受干扰、线性范围有限
酶联分析法	中-高	高	高	否	通量高、易自动化、灵敏度良好	试剂盒依赖性较高
HPLC	中	中	低	是	可同时分离多种代谢物	需衍生化、灵敏度相对较低
LC-MS/MS	极高	极高	中	是	灵敏度/特异性顶尖、无需衍生化	设备昂贵、操作复杂、成本高

未来方向： 提升单细胞/亚细胞水平PEP检测技术、开发更便捷高灵敏即时检测方法、拓展多组学整合分析平台应用。

结论

磷酸烯醇丙酮酸检测是理解能量代谢稳态、诊断相关遗传病、探究代谢性疾病（如糖尿病、癌症）机制的关键手段。从经典的酶学方法到尖端的LC-MS/MS技术，不同方法各有优劣。研究者需紧密结合具体需求（灵敏度、特异性、通量、样本类型、成本）选择最适检测策略，并严格规范样本处理与分析流程，方能获得可靠的PEP数据，为生命科学研究与临床诊疗提供坚实依据。

参考文献（示例类型）：

Bergmeyer, H. U. (Ed.). Methods of Enzymatic Analysis. Academic Press.（经典酶学方法权威参考）
Lowry, O. H., & Passonneau, J. V. (1972). A Flexible System of Enzymatic Analysis. Academic Press. （代谢物分析的经典系统）
Yuan, M., et al. (2012). Simultaneous determination of glycolytic intermediates. Journal of Chromatography B, ... （LC-MS/MS应用实例）
Beutler, E. (1984). Red Cell Metabolism: A Manual of Biochemical Methods. Grune & Stratton. （血液代谢疾病诊断手册）
Kanehisa, M., et al. (2023). KEGG PATHWAY Database.（理解PEP代谢通路）