二羟丙酮磷酸检测

发布时间：2025-06-28 08:01:39 阅读量：1 作者：生物检测中心

二羟丙酮磷酸检测：原理、方法与应用

二羟丙酮磷酸（Dihydroxyacetone phosphate，简称DHAP）是糖酵解途径中的关键中间代谢物，在甘油代谢、糖异生以及脂质合成中扮演重要角色。对其浓度的准确测定在基础生化研究、代谢性疾病诊断（如遗传性果糖不耐受）以及细胞能量代谢评估等方面具有重要意义。以下为DHAP检测的完整技术说明：

一、 检测原理（酶偶联法）

目前最常用且特异性高的检测方法是基于酶促反应的分光光度法（紫外法） ，核心原理如下：

  1. 样品去蛋白化与提取： 生物样本（血液、组织匀浆、细胞裂解液等）需迅速处理以防止DHAP降解。通常加入冰冷的高氯酸（或三氯乙酸）溶液沉淀蛋白质，离心后取上清液（酸提取液）。上清液需用碱性溶液（如KOH或KHCO₃）中和至中性pH（约7.0-7.5），并去除生成的盐沉淀（如KClO₄），得到可用于酶反应的中和提取液。
  2. 酶促反应： 在中和提取液中依次加入：
    • 甘油-3-磷酸脱氢酶（Glycerol-3-phosphate dehydrogenase， GPDH， EC 1.1.1.8）： 此酶特异性催化DHAP还原为L-甘油-3-磷酸（L-Glycerol-3-phosphate, G-3-P），同时伴随还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）氧化为氧化型（NAD⁺）。
    • 还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）： 作为反应的辅因子和指示剂。
      反应方程式：
  
 
 
 
DHAP + NADH + H⁺ ⇌ L-Glycerol-3-phosphate + NAD⁺
  1. 信号测定： 反应在特定缓冲液（如三乙醇胺缓冲液，pH ~7.5）中进行。随着反应的进行，NADH被氧化成NAD⁺，导致其在340 nm波长处的吸光度（A₃₄₀）下降。
  2. 定量计算： DHAP的浓度与A₃₄₀的下降值（ΔA₃₄₀）成正比。根据朗伯-比尔定律（Lambert-Beer law）和NADH的摩尔消光系数（ε₃₄₀ ≈ 6.22 × 10³ L mol⁻¹ cm⁻¹），可计算出样品中DHAP的含量。
  
 
 
 
DHAP浓度 (μmol/L) = (ΔA₃₄₀ × V_t × DF) / (ε₃₄₀ × d × V_s)
 
 
 
* ΔA₃₄₀：反应混合液在340 nm处吸光度的降低值。 * V_t：反应混合液总体积（mL）。 * DF：样品稀释倍数（从原始样品到最终用于酶反应的中和提取液的稀释倍数）。 * ε₃₄₀：NADH在340 nm处的摩尔消光系数（L mol⁻¹ cm⁻¹）。 * d：比色杯光径（cm）。 * V_s：加入反应体系中含DHAP的中和提取液体积（mL）。

二、 关键步骤与注意事项

  1. 样品快速处理： DHAP在红细胞和某些组织中极不稳定（半衰期短），样品采集后应立即置于冰上，并尽快进行去蛋白化步骤（建议在1-2分钟内完成离心分离血浆/血清或加入沉淀剂）。血液样品推荐使用肝素或EDTA抗凝，避免使用含氟化物的抗凝剂（可能抑制酶活性）。
  2. 彻底去蛋白与中和： 蛋白质会干扰酶反应和吸光度测定。中和步骤必须小心操作，确保最终反应混合液的pH在GPDH的最适pH范围内（通常为7.0-7.8）。中和过程中避免局部过碱导致DHAP破坏。
  3. 试剂纯度与酶特异性：
    • 使用高纯度的NADH（避免含有杂质干扰吸光度）。
    • 确保GPDH具有高活性和特异性（对DHAP）。需注意市售GPDH的来源（如兔肌来源），不同来源酶的特性可能略有差异。应验证试剂空白。
  4. 干扰物质控制：
    • 甘油（Glycerol）： 样品中的游离甘油是主要干扰源之一，因为它可以被少量存在的α-甘油磷酸脱氢酶（α-GPDH，如果试剂或样品中存在）氧化，消耗NADH，导致假性DHAP升高。解决方法：
      • 空白对照： 在另一份样品中预先加入甘油激酶（Glycerol kinase， GK， EC 2.7.1.30） 和ATP，将游离甘油磷酸化为L-α-甘油磷酸（L-α-Glycerolphosphate, α-GP）。α-GP在后续加入NADH和GPDH时不会被氧化（GPDH特异性作用于DHAP）。此反应测得的读数代表了甘油背景。最终DHAP浓度为 （总NADH消耗读数 - 甘油背景读数）。
      • 选用甘油含量低的试剂。
    • 内源性物质： 某些组织或细胞中可能存在的其他脱氢酶或其底物也可能消耗或再生NADH。设置合理的样品空白（不加GPDH）有助于校正。
    • 酶抑制剂： 确保提取液中的去蛋白剂（如高氯酸根离子）在中和后浓度足够低，不会抑制GPDH活性。
  5. 反应条件优化：
    • 温度： 反应通常在25°C或30°C恒温比色槽中进行。
    • 时间： 反应需进行至终点（通常几分钟内完成），确保反应完全。监测吸光度变化直至达到平台期。
    • 试剂浓度： 确保加入的GPDH酶量足够，使反应在合理时间内完成；NADH浓度需过量以保证线性关系。
  6. 标准曲线： 建议每次检测时使用已知浓度的DHAP标准品制备标准曲线，以提高准确性，并验证酶反应体系的性能。
 

三、 应用领域

  1. 基础研究：
    • 糖酵解、糖异生、甘油代谢通路通量分析。
    • 线粒体呼吸功能与糖代谢关联研究。
    • 细胞能量代谢状态评估（例如，DHAP/Glyceraldehyde-3-phosphate比值变化）。
  2. 临床诊断：
    • 遗传性果糖不耐受（Hereditary Fructose Intolerance, HFI）： 这是最重要的临床应用。HFI患者缺乏醛缩酶B（Aldolase B），食用果糖后导致果糖-1-磷酸（Fructose-1-phosphate, F1P）在肝细胞内堆积。F1P抑制糖原分解和糖异生关键酶，导致葡萄糖生成受阻和低血糖。同时，F1P也抑制甘油醛脱氢酶，导致其前体物质DHAP在血液中显著升高（禁食后给予果糖负荷试验）。检测血浆或全血中DHAP浓度是HFI辅助诊断的重要生化指标之一（常与果糖、乳酸、尿酸、血糖等联合检测）。注意： 样本采集时机（通常在果糖负荷后特定时间点）和快速处理对结果可靠性至关重要。
    • 其他涉及糖酵解或甘油代谢异常的疾病研究。
 

四、 方法优缺点总结

  • 优点：
    • 高特异性： GPDH对DHAP催化具有高度专一性。
    • 高灵敏度： 可检测低浓度（μmol/L级别）的DHAP。
    • 相对简便： 所需仪器（紫外/可见分光光度计）普及。
  • 缺点：
    • 样品处理要求高： 需要快速操作以防止DHAP降解，去蛋白和中和步骤相对繁琐。
    • 存在潜在干扰： 主要是游离甘油，需要通过设置甘油空白对照来校正。
    • 酶成本： 需要用到纯度较高的酶制剂。
    • 无法区分DHAP异构体： 该方法检测的是DHAP的总量。在生理条件下，DHAP主要以单体形式存在，其异构体甘油醛-3-磷酸（GAP）在反应平衡中比例极小（约4%），且两者在代谢通路中快速相互转化，通常认为测定总DHAP（即DHAP + GAP）足以满足大多数应用需求。严格来说，该方法测得的是“磷酸二羟丙酮+甘油醛-3-磷酸”的总和（常统称为“三碳糖磷酸”或Triose phosphates）。但在HFI等病理状态下，升高的主要是DHAP本身。
 

五、 结论

酶偶联分光光度法（基于GPDH和NADH）是检测生物样品中二羟丙酮磷酸（DHAP）浓度可靠且常用的方法。其成功应用的关键在于严格遵守快速样品处理、彻底去蛋白与中和、有效控制（主要是甘油）干扰以及精确的操作流程。该方法在揭示糖代谢基础机制和辅助诊断遗传性果糖不耐受等代谢性疾病中发挥着不可替代的作用。研究人员和临床实验室在实施检测时，应建立并严格遵守标准操作规程和质量控制措施以确保结果的准确性和可靠性。

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