氨基糖苷类抗生素检测

发布时间:2025-06-28 08:01:39 阅读量:3 作者:生物检测中心

氨基糖苷类抗生素检测:方法、意义与挑战

一、引言

氨基糖苷类抗生素(Aminoglycoside Antibiotics, AGs)是一类结构中含有氨基糖分子、具有强大杀菌活性的重要抗生素。主要包括链霉素、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、妥布霉素、阿米卡星等。它们通过不可逆地结合细菌核糖体30S亚基,干扰蛋白质合成,对多种革兰氏阴性菌和部分革兰氏阳性菌有效。广泛应用于临床治疗严重感染(如败血症、复杂尿路感染、结核病辅助治疗)以及畜牧业和水产养殖业中。

然而,此类药物的治疗窗窄(有效血药浓度与中毒浓度接近),具有显著的剂量依赖性耳毒性和肾毒性。在食品动物中使用后可能产生残留,通过食物链进入人体,可能导致过敏反应、破坏肠道菌群平衡及诱导耐药菌株产生。环境中(如水体和土壤)的残留也可能对生态系统造成潜在风险。因此,对氨基糖苷类抗生素在药品、食品(特别是动物源性食品如肉、蛋、奶、蜂蜜、水产品)、饲料、环境样品及临床生物样本(血、尿)中进行准确、灵敏、高效的检测至关重要,是保障用药安全、食品安全、环境安全和公众健康的必要手段。

二、检测的意义与对象

  1. 药品质量控制: 确保原料药和制剂符合规定的纯度、含量和杂质限度标准。
  2. 食品安全监测:
    • 动物源性食品残留监控: 严格执行国家及国际规定的最大残留限量(MRLs),防止违规使用或停药期不足导致的残留超标。
    • 蜂蜜、水产品监控: 监控养殖过程中可能的违规使用。
    • 保障消费者健康: 减少长期低剂量摄入潜在的健康风险(过敏、耐药性、菌群失调)。
  3. 饲料安全监控: 防止饲料中非法添加或过量添加用于促生长。
  4. 环境监控: 检测制药废水、养殖场废水、受污染土壤和水体中的残留,评估环境风险。
  5. 临床治疗药物监测(TDM): 监测患者(尤其是肾功能不全者、重症感染患者、新生儿)血液中的药物浓度,优化给药方案,确保疗效并最大限度降低耳肾毒性风险。
 

三、主要检测方法

氨基糖苷类化合物的理化性质(强极性、水溶性好、缺乏特征紫外吸收或荧光、热不稳定性)给分析带来了挑战。检测方法需根据检测目的、样品基质、灵敏度要求、通量需求和可用设备进行选择。

  1. 微生物学检定法:

    • 原理: 利用特定敏感菌株(如枯草芽孢杆菌、藤黄微球菌)的生长抑制程度与抗生素浓度呈正相关的关系。
    • 方法: 常用管碟法(扩散法)或浊度法。
    • 优点: 设备要求低,成本相对低廉,能反映生物活性总量(对含多种组分的AGs如庆大霉素有优势),是某些药典标准方法。
    • 缺点: 特异性差(无法区分单个组分,易受其他抗生素干扰),灵敏度相对较低(尤其对低浓度残留),耗时长(通常需要18-24小时培养),精密度和准确度相对较低,易受实验条件(pH、温度、培养基成分)影响,通量低。
    • 应用: 主要用于药品效价测定初筛,在食品残留和环境监测中已逐渐被仪器方法取代。
  2. 免疫分析法:

    • 原理: 利用抗原(目标氨基糖苷)与特异性抗体结合的特性。
    • 方法: 酶联免疫吸附试验(ELISA)、胶体金免疫层析试纸条、荧光免疫分析、放射免疫分析(RIA,现已少用)等。
    • 优点: 特异性较好(针对特定目标物),灵敏度高(可达μg/kg甚至ng/kg级),操作简便快速(尤其试纸条,几分钟出结果),样品前处理相对简单,适合大批量样本现场快速筛查。
    • 缺点: 通常一次只能检测一种或一类结构非常相似的AGs(交叉反应可能导致假阳性/阴性),抗体制备困难且可能存在批次差异,定量准确性有时不如色谱法,存在基质效应干扰的可能。
    • 应用: 广泛应用于食品、饲料和环境样品的高通量现场快速初筛。阳性样品需用确证方法验证。
  3. 色谱及相关联用技术:

    • 高效液相色谱法(HPLC):
      • 挑战: AGs强极性导致在反相色谱柱上保留弱,缺乏紫外/可见光生色团限制了直接检测。
      • 解决方案:
        • 柱前/柱后衍生化: 与衍生化试剂(如邻苯二甲醛 - OPA、芴甲氧羰酰氯 - FMOC-Cl、乙酰丙酮/甲醛等)反应生成具有强紫外吸收或荧光的衍生物。OPA衍生(柱前)结合荧光检测(FLR)是最常用的HPLC方法。
        • 亲水作用色谱(HILIC): 使用极性固定相和高比例有机相(乙腈)的流动相,提高强极性AGs的保留和分离。常与质谱联用(HILIC-MS/MS),也可结合衍生化和紫外/荧光检测。
      • 优点: 可分离多种AGs组分(如庆大霉素C1, C1a, C2),定量准确度较好。
      • 缺点: 衍生化步骤增加操作复杂性和时间,可能引入误差;衍生产物可能不稳定;灵敏度通常低于质谱法。
      • 应用: 在药品质量控制和一些残留检测实验室仍有应用。
    • 液相色谱-质谱联用(LC-MS/MS):
      • 原理: HPLC分离后,进入三重四极杆质谱(QQQ),通过母离子扫描、子离子扫描(MS/MS)实现高选择性、高灵敏度的定性和定量分析(多反应监测MRM模式)。
      • 优势:
        • 高特异性: MRM模式极大降低基质干扰,可同时检测多种AGs及其组分。
        • 高灵敏度: 检测限可达μg/kg甚至ng/kg级别,满足痕量残留检测要求。
        • 无需衍生化: 可直接分析,简化流程,提高分析通量和稳定性。
        • 定性能力强: 提供化合物的分子量和结构碎片信息,有利于确证。
      • 关键点:
        • 电离方式: AGs为碱性化合物,常采用电喷雾电离正离子模式(ESI+)
        • 色谱分离: 反相色谱(RP-LC,常用C18柱)结合离子对试剂(如七氟丁酸、三氟乙酸、戊磺酸钠等)改善保留和峰形是主流方法。HILIC与MS/MS联用也日益成熟,无需离子对试剂,但需优化色谱条件以避免基质效应。
        • 基质效应: 复杂的样品基质会显著抑制或增强离子化效率,需通过优化前处理、使用同位素内标或标准加入法进行校正。
      • 应用: 目前公认的金标准方法。广泛应用于食品、饲料、环境、药品和临床生物样本中多种氨基糖苷类抗生素的定性和定量检测及确证分析。
    • 毛细管电泳(CE):
      • 原理: 基于样品中各组分在高压电场作用下于毛细管缓冲溶液中的迁移速率不同进行分离。
      • 优势: 高效分离(理论塔板数高),样品和溶剂消耗量极小。
      • 挑战: 检测灵敏度不足(常用紫外检测同样面临AGs无吸收问题)。解决方案包括样品预富集(如场放大进样、固相萃取)、间接紫外检测或与质谱联用(CE-MS/MS)。
      • 应用: 在特定研究领域(如代谢研究)有一定应用,但在常规检测中普及度不如LC-MS/MS。
 

四、样品前处理

复杂基质中痕量AGs的准确检测高度依赖于有效的样品前处理,目标是提取目标物、去除干扰基质、富集目标物并适应后续分析仪器。

  1. 提取:

    • 常用溶剂: 酸性水溶液(磷酸盐缓冲液、三氯乙酸溶液)、水、甲醇/水混合溶液、含离子对试剂的溶液(如七氟丁酸水溶液)。
    • 方法: 涡旋混合、振荡提取、超声辅助提取。肉类、组织样品常需均质后提取。
    • 关键: 考虑目标AGs的极性和溶解度,选择合适的提取溶剂使目标物尽可能溶出。
  2. 净化与富集:

    • 固相萃取(SPE): 最常用且最有效的净化方法。
      • 吸附剂选择:
        • 阳离子交换(SCX): 基于AGs的强碱性(带正电荷),是最主流的选择。常用填料如苯磺酸基(如ProElut PXC)。
        • 混合模式阳离子交换(MCX): 结合反相(C8/C18)和强阳离子交换基团,净化效果更佳。
        • 亲水亲脂平衡(HLB): 通用性强,但对AGs的选择性不如离子交换柱。
      • 流程: 活化、上样(样品提取液通常调至酸性)、淋洗(去除杂质)、洗脱(用含碱性物质如氨水的甲醇/水溶液将带正电的AGs洗脱下来)、浓缩(氮吹或真空离心浓缩)。
    • 其他方法: 液液萃取(LLE,效率低,较少用)、QuEChERS(改良法可用于AGs,但净化效果通常不如SPE)、分子印迹聚合物(MIPs,具有高选择性,但商品化成熟吸附剂少)。
 

五、质量控制与标准

  1. 标准物质: 使用高纯度、有证标准物质(CRM)进行方法开发和定量校准。
  2. 回收率试验: 在空白样品中添加已知浓度的目标物标准品,考察方法的回收率(通常要求60-120%)。
  3. 精密度试验: 考察方法的重现性(同一实验室内)和重复性(不同时间、人员、设备)。
  4. 空白试验: 防止交叉污染和假阳性。
  5. 基质匹配校准曲线: 使用经处理的空白基质溶液配制标准系列,有效抵消基质效应,提高定量准确性(尤其对LC-MS/MS)。
  6. 同位素内标法: 使用目标物的稳定性同位素标记物(如D5-链霉素、C13-N1-庆大霉素)作为内标,校正前处理损失和仪器响应的波动,是LC-MS/MS检测的首选定量策略。
  7. 检出限(LOD)与定量限(LOQ): 满足法规要求(如MRLs)。
  8. 方法验证/确认: 严格遵循相关国际(AOAC, ISO, ICH)或国家标准/指南进行全面的方法验证(特异性、线性、准确度、精密度、LOD/LOQ、耐用性等)。
 

六、挑战与展望

  1. 挑战:
    • 样品基质复杂性: 食品、饲料和环境样品成分多样,干扰严重,前处理要求高。
    • 痕量检测需求: MRLs不断降低,对方法的灵敏度提出更高要求。
    • 多种组分同时分析: 如庆大霉素三种主要组分(C1, C1a, C2)和新霉素多种组分需要有效分离和定量。
    • 结构类似物区分: 如链霉素与二氢链霉素(分子量相同,仅双键差异),需优化质谱条件和色谱分离。
    • 基质效应(LC-MS/MS): 仍是影响准确性的重要因素。
    • 快速现场检测需求: 现有快速方法(如免疫法)在通量、成本和确证能力上仍有局限。
  2. 展望:
    • LC-MS/MS技术持续优化: 更高分辨率、更高灵敏度的质谱仪(如QTOF, Orbitrap),结合更智能的数据处理软件。新型HILIC固定相的开发和应用。
    • 高效前处理技术: 自动化SPE平台、磁性固相萃取(MSPE)、分散固相萃取(d-SPE)、在线SPE-LC-MS/MS联用技术,提高效率和通量。
    • 新型识别材料: 高特异性、高稳定性的抗体、适配体(Aptamer)用于改进免疫分析和传感器。分子印迹聚合物(MIPs)的商品化应用。
    • 生物传感器与快速检测: 开发低成本、便携式、高灵敏度和特异性的生物传感器(如基于适配体、酶、纳米材料),实现真正的现场快速定量或半定量筛查。
    • 多残留高通量平台: 实现AGs与其他类抗生素(β-内酰胺类、磺胺类、大环内酯类等)在一次进样中的同时筛查和确证。
 

七、结论

氨基糖苷类抗生素的检测是保障药品质量、食品安全、环境健康和临床用药安全的关键环节。微生物法、免疫分析法、色谱及质谱技术各有其适用场景和优缺点。其中,液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)凭借其高特异性、高灵敏度、多组分同时分析能力和强大的确证能力,已成为当前最主流和最可靠的分析技术。可靠的分析结果依赖于严谨高效的样品前处理(尤其是固相萃取)和严格的质量控制措施(如回收率试验、基质匹配校准、同位素内标应用)。

随着技术的进步,检测方法正朝着更高灵敏度、更高通量、更高效自动化、更智能化和更便携化的方向发展,并致力于解决复杂基质干扰、痕量组分准确定量以及现场快速筛查确证等核心挑战。持续发展的检测技术将为有效监控氨基糖苷类抗生素的合理使用、防范其残留危害提供坚实的技术支撑。