去氧胆酸（DCA）/脱氧胆酸（DHCA）检测

去氧胆酸（DCA）与脱氧胆酸（DHCA）检测：原理、方法与临床应用

一、引言

胆汁酸是胆固醇在肝脏代谢产生的重要两性分子，在脂肪消化、脂溶性维生素吸收及胆固醇稳态调节中发挥核心作用。去氧胆酸（Deoxycholic Acid, DCA） 与 脱氧胆酸（Deoxycholic Acid, DHCA） 是肠道菌群作用于初级胆汁酸（胆酸CA、鹅脱氧胆酸CDCA）产生的次级胆汁酸。它们在维持肠道微生态平衡、信号传导等方面具有重要生理功能，其浓度的异常变化常与多种肝胆、肠道疾病及代谢紊乱密切相关。因此，准确检测体液中DCA与DHCA的水平具有重要的临床及科研价值。

二、检测原理与技术方法

检测DCA和DHCA的核心在于其区分与定量，主要依赖其化学结构差异（羟基数目与位置）以及理化性质（如极性）。

1. 样本采集与预处理：

   • 常见样本： 血清/血浆（最常用）、粪便（反映肠道代谢）、胆汁、尿液。
   • 关键步骤：
     • 去蛋白化： 血样需去除蛋白质（如甲醇、乙腈沉淀，酸化沉淀）。
     • 萃取： 液液萃取（LLE，常用溶剂如乙酸乙酯、乙醚、甲基叔丁基醚）或固相萃取（SPE，使用特定吸附剂小柱）富集目标胆汁酸并去除基质干扰。
     • 衍生化： 针对色谱法（尤其气相色谱GC），常需将胆汁酸转化为挥发性更强或带紫外/荧光标记的衍生物（如甲酯化、硅烷化、荧光标记衍生化）。

2. 主要检测技术：

   • 酶联免疫吸附测定（ELISA）：
     • 原理： 基于抗原-抗体特异性结合。使用针对DCA或DHCA的特异性抗体包被微孔板，样本中的目标胆汁酸与标记物（酶标记）竞争结合抗体位点。酶催化底物显色，颜色深浅与目标物浓度成反比。
     • 特点： 操作相对简便、通量高、成本较低。但可能存在交叉反应（与其他结构相似胆汁酸），灵敏度、特异性通常低于色谱法，适用于大批量初筛。
   • 高效液相色谱（HPLC）：
     • 原理： 基于极性差异在色谱柱中进行分离。常用反相C18色谱柱，甲醇/乙腈-水（常含缓冲盐或酸）梯度洗脱。
     • 检测器：
       • 紫外检测器（UV）： DCA/DHCA在200nm左右有吸收。灵敏度较低，特异性易受干扰，常需衍生化增强信号。
       • 荧光检测器（FLD）： 需进行荧光衍生化（如使用溴甲基香豆素等），大幅提高灵敏度和选择性。
       • 蒸发光散射检测器（ELSD）/ 示差折光检测器（RID）： 通用型检测器，无需衍生化，但灵敏度通常低于荧光和质谱。
   • 液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）：
     • 原理： HPLC分离后，胆汁酸分子在离子源（如电喷雾离子化ESI）中电离，特定母离子在碰撞室碎裂生成特征子离子，三重四极杆质谱选择性地监测这些离子对（母离子/子离子）。
     • 特点： 金标准方法。具有超高灵敏度、卓越特异性（基于精确质量和特征碎片）、可同时检测多种胆汁酸轮廓。通常无需衍生化即可直接分析。同位素内标（如氘代DCA/DHCA）可校正基质效应和回收率损失，保证定量准确性。
   • 气相色谱-质谱（GC-MS）：
     • 原理： 需将胆汁酸衍生化为挥发性和热稳定的衍生物（甲酯+硅烷化），经GC毛细管柱分离，质谱检测。
     • 特点： 分离效率高，专属性好。但衍生化步骤繁琐耗时，不适合热不稳定或难挥发性化合物，应用不如LC-MS/MS广泛。

三、临床应用价值

DCA和DHCA检测在多种疾病诊断、病情评估、治疗监测及机制研究中具有重要价值：

1. 肝胆系统疾病：

   • 胆汁淤积性疾病： 血清总胆汁酸（TBA）升高是重要指标。测定DCA、DHCA等各组分的比例（如DCA/CA比值）有助于评估淤积程度、肝损伤及预后判断。
   • 肝硬化/肝纤维化： 血清中硫酸化胆汁酸（如硫酸化DCA）比例显著升高，可作为评估肝功能和疾病进展的标志物。
   • 胆石症/胆囊疾病： 胆汁酸代谢异常（如DCA比例改变）与胆固醇结石形成有关。

2. 肠道疾病与菌群研究：

   • 肠道菌群失调： DCA、DHCA等次级胆汁酸由特定肠道细菌（如Clostridium簇XIVa菌）产生。粪便中DCA、DHCA水平及比例（如DCA/CDCA）是反映肠道菌群功能状态的重要生物标志物。
   • 炎症性肠病（IBD）： 患者胆汁酸代谢谱异常（如DCA水平降低），与菌群紊乱、肠屏障功能障碍相关。
   • 结直肠癌（CRC）： DCA等次级胆汁酸过高水平被认为具有潜在的致癌风险或促进肿瘤进展的作用。检测其在粪便或血清中的水平可能与风险评估相关。
   • 小肠细菌过度生长（SIBO）/吸收不良： 影响胆汁酸肠肝循环，导致血清和粪便胆汁酸谱改变。

3. 代谢性疾病：

   • 非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）/非酒精性脂肪性肝炎（NASH）： 胆汁酸信号通路紊乱是重要发病机制之一，特定胆汁酸谱（包括DCA/DHCA的变化）与疾病严重程度相关。
   • 2型糖尿病/肥胖： 胆汁酸作为信号分子参与糖脂代谢调节。研究显示，循环及粪便中胆汁酸谱（包括次级胆汁酸）的变化与胰岛素抵抗、肥胖等状态相关。

4. 药物研发与评价： 评估靶向胆汁酸代谢通路药物（如FXR激动剂、回肠胆汁酸转运体抑制剂、菌群调节剂）的有效性与安全性。

四、结果解读与注意事项

1. 参考范围： 血清胆汁酸浓度存在明显的个体差异、昼夜节律波动（餐后升高），且受检测方法学影响极大。不同实验室应建立自己的方法特异性参考区间。解读结果时必须结合检测方法、样本类型、患者状态（是否空腹）、临床背景等综合判断。
2. 综合分析： 单独测定DCA或DHCA价值有限。通常需要结合总胆汁酸（TBA）、初级胆汁酸（CA, CDCA）及其他次级胆汁酸（如石胆酸LCA）、结合型/游离型比例等“胆汁酸谱”进行综合分析，才能提供更全面的病理生理信息（肝胆功能、菌群活性、吸收状态）。
3. 方法学选择的影响： ELISA便捷但需关注其特异性；HPLC-UV/FLD需要良好分离和衍生化；LC-MS/MS是最准确可靠的方法，尤其适合复杂基质和多组分分析。

五、总结与展望

准确检测去氧胆酸（DCA）和脱氧胆酸（DHCA）是深入理解胆汁酸代谢及其在健康和疾病中作用的关键。随着液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术的普及和发展，多组分胆汁酸谱的同时、高灵敏度、高特异性分析已成为临床和科研的主流手段。这些检测技术为肝胆疾病、肠道菌群相关疾病以及代谢性疾病的诊断、分型、预后评估、靶向治疗提供了重要的生物标志物信息。未来研究将继续深化对特定胆汁酸（尤其是次级胆汁酸如DCA/DHCA）生理病理意义的认识，优化检测流程（如自动化前处理），推动标准化进程（如参考物质和方法），并探索其在精准医疗和个性化健康管理中的应用潜力。