土壤谷氨酰胺酶(S-GLS) 活性检测

发布时间：2025-06-28 08:01:39 阅读量：1 作者：生物检测中心

土壤谷氨酰胺酶(S-GLS)活性检测方法

土壤谷氨酰胺酶(S-Glutaminase, S-GLS)是参与土壤氮素循环的关键酶之一，催化谷氨酰胺水解生成谷氨酸和铵离子(NH₄⁺)。其活性反映了土壤中有机氮矿化为植物可利用无机氮的潜能。以下是基于广泛应用的比色法建立的标准化检测流程：

一、检测原理
谷氨酰胺酶催化以下反应：
L-谷氨酰胺 + H₂O → 谷氨酸 + NH₃
在弱碱性环境中，释放的NH₃立即转化为NH₄⁺。通过苯酚-次氯酸钠显色反应（Berthelot反应）定量测定反应生成的NH₄⁺量，其蓝色产物在625 nm波长处具有最大吸光度。酶活性以单位时间内单位质量干土生成的NH₄⁺量表示（通常为 μmol NH₄⁺ g⁻¹ dry soil h⁻¹）。

二、实验材料

  1. 土壤样品： 新鲜采集的土壤样品，去除可见植物残体及石块。检测前保存于4°C（短期）或-20°C（长期）。若使用冷冻样品，需在4°C解冻。
  2. 试剂：
    • 基质溶液 (0.1 M L-谷氨酰胺)： 准确称取L-谷氨酰胺溶于预冷的50 mM Tris-HCl缓冲液(pH 10.0) 或 50 mM磷酸钠缓冲液(pH 10.0)，现配现用或分装-20°C保存。
    • 缓冲液 (50 mM, pH 10.0)： 推荐使用Tris-HCl缓冲液或磷酸钠缓冲液。精确配制并校准pH。
    • 反应终止剂 (2 M KCl 溶液)： 含适量甲苯（约0.5 mL/L）以抑制酶活。
    • 显色剂A (苯酚-硝普纳溶液)： 溶解苯酚及少量硝普纳于蒸馏水（避光保存）。
    • 显色剂B (碱性次氯酸钠溶液)： 含次氯酸钠及氢氧化钠（避光、低温保存）。
    • 铵离子标准储备液 (1 M NH₄Cl)： 精确称取氯化铵配制于蒸馏水。
    • 铵离子标准工作液： 用终止剂（2 M KCl）稀释储备液，配制梯度浓度（如 0, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4 mM NH₄⁺）。
  3. 玻璃器皿与耗材： 离心管、锥形瓶、容量瓶、移液器及枪头、比色皿。
  4. 仪器设备： 恒温水浴摇床或培养箱（37°C或50°C）、分光光度计、离心机、pH计、涡旋混合器。
 

三、检测步骤

  1. 土壤预处理：
    • 新鲜土壤过2 mm筛，测定含水量。
    • 称取相当于1.0 g干土重的新鲜土壤（精确至0.001 g），置于离心管中。
    • 设置两组平行样：处理组（Inc）与无基质对照组（Con）。
  2. 底物添加与反应：
    • 处理组 (Inc)： 向土壤样品中加入2.5 mL基质溶液（0.1 M谷氨酰胺溶于缓冲液）。
    • 无基质对照组 (Con)： 向土壤样品中加入2.5 mL缓冲液（不含底物）。
    • 密封离心管，涡旋混匀10-15秒。
    • 将样品置于恒温水浴摇床中（推荐37°C或50°C），避光振荡培养（如150 rpm）2小时。精确计时。
  3. 反应终止：
    • 培养结束后，立即向每个样品中加入5 mL预冷的2 M KCl终止剂（含甲苯）。
    • 涡旋混匀1分钟。
  4. 铵离子提取：
    • 将终止后的悬液于4°C静置30分钟。
    • 3500-4000 rpm离心10分钟。
    • 小心吸取上清液至洁净容器中备用。
  5. 铵离子测定（显色反应）：
    • 取适量上清液（如1 mL）至试管或比色皿中。
    • 依次加入1 mL显色剂A（苯酚-硝普纳）和1 mL显色剂B（碱性次氯酸钠）。
    • 立即涡旋混匀。
    • 室温下避光显色30分钟。
  6. 吸光度测定：
    • 使用分光光度计，在625 nm波长处读取样品的吸光度（OD₆₂₅）。
    • 以无基质对照组（Con）作为本底（校正土壤自身释放的NH₄⁺及显色背景）。
    • 同时测定铵离子标准工作液系列浓度，绘制标准曲线（OD₆₂₅ vs. NH₄⁺浓度）。
 

四、数据计算

  1. 根据标准曲线计算NH₄⁺含量：
    • 从处理组（Inc）吸光度值中减去无基质对照组（Con）吸光度值，得到净吸光度值（ΔOD）。
    • 利用铵离子标准曲线方程（y = mx + c， y为OD值，x为NH₄⁺浓度），将ΔOD换算为反应体系中生成的NH₄⁺浓度（C, mM）。
  2. 计算酶活性：
    土壤谷氨酰胺酶活性 (μmol NH₄⁺ g⁻¹干土 h⁻¹) = [ (C * V * D) / (W * T) ] * 1000
    • C： 根据标准曲线计算的净NH₄⁺浓度 (mM)
    • V： 提取所用终止剂体积 (mL)，此处为5 mL
    • D： 显色测定前的稀释倍数（若未稀释则为1）
    • W： 土壤干重 (g)
    • T： 培养时间 (小时)，此处为2小时
    • 1000： 将mmol转换为μmol的换算因子
 

五、质量控制与注意事项

  1. 平行实验： 每组样品（Inc和Con）至少设置3个重复以保证数据可靠性。
  2. 空白对照： 除无基质土壤对照外，可设置试剂空白（无土壤，仅含缓冲液、基质及终止剂），进一步校正背景值。
  3. 温度与时间控制： 培养温度和时间必须严格保持一致，其对反应速率影响显著。
  4. 基质稳定性： L-谷氨酰胺溶液易分解，需新鲜配制或妥当冷冻保存。避免反复冻融。
  5. 显色条件： 显色剂需避光保存，现用现混。显色时间需精确控制以保证结果可比性。
  6. 土壤性质影响： 土壤pH、有机质含量、质地等因素会影响酶活性，报告结果时应注明相关土壤理化性质。
  7. 干扰排除： 土壤中其他含氮化合物或还原性物质可能干扰显色。必要时进行预实验或采用透析等方法纯化酶液（针对提取酶法）。
  8. 标准曲线线性： 确保标准曲线在检测范围内呈良好的线性关系（R² > 0.99）。
 

六、方法应用与意义
本方法操作相对简便，灵敏度较高，适用于不同类型土壤中S-GLS活性的批量测定。通过监测S-GLS活性，可：

  • 评估土壤氮素矿化潜力和氮有效性。
  • 研究农业管理措施（施肥、耕作、轮作等）对土壤氮循环的影响。
  • 评价污染物（重金属、农药等）对土壤微生物氮代谢功能的胁迫效应。
  • 揭示土壤生态系统的恢复状况和健康质量。
 

参考文献
该方法主要基于经典土壤酶学方法建立，如：

  • Tabatabai, M.A. (1994). Soil enzymes. In Methods of Soil Analysis: Part 2 Microbiological and Biochemical Properties (R.W. Weaver, S. Angle, P. Bottomley, D. Bezdicek, S. Smith, A. Tabatabai, & A. Wollum, Eds.), SSSA Book Series No. 5. Soil Science Society of America, Madison, WI. pp. 775-833.
  • Kandeler, E., & Gerber, H. (1988). Short-term assay of soil urease activity using colorimetric determination of ammonium. Biology and Fertility of Soils, 6(1), 68-72. (显色方法原理)
  • Bremner, J.M. (1960). Determination of nitrogen in soil by the Kjeldahl method. The Journal of Agricultural Science, 55(1), 11-33. (Berthelot反应应用背景)
 

重要声明： 本研究方法描述基于公开发表的科学原理和通用实验室操作，仅提供标准化流程以供科研参考。实验操作需严格遵守实验室安全规范。