土壤脱氢酶(SDHA)活性检测

发布时间：2025-06-28 08:01:39 阅读量：1 作者：生物检测中心

土壤脱氢酶(SDHA)活性检测

一、 引言

土壤脱氢酶（EC 1.1.1.*，常简称SDHA）是土壤微生物代谢过程中的一类关键氧化还原酶。它主要催化有机物脱氢（氧化）的第一步反应，将氢原子从有机底物转移给特定的受体。其活性是评估土壤微生物总体代谢强度、氧化还原能力及土壤生物学活性的重要敏感指标。SDHA活性检测广泛应用于土壤健康评价、有机污染物降解潜力评估、重金属污染生态毒性研究、农业管理措施（如施肥、耕作、有机物添加）对土壤生物学质量的影响监测，以及土壤修复效果评价等领域。

二、 检测原理（INT还原法）

目前最常用的土壤脱氢酶活性检测方法是基于人工电子受体（如2,3,5-三苯基氯化四唑，TTC）的还原显色原理。本方案以INT（2-对碘苯基-3-对硝基苯基-5-苯基氯化四唑）为例，因其水溶性更好且产物颜色更深：

  1. 脱氢反应： 土壤样品中加入含有适宜浓度INT的缓冲基质溶液（常用Tris-HCl或磷酸盐缓冲液）。在适宜的温度（通常37°C）和黑暗条件下孵育一定时间（通常数小时）。
  2. 还原显色： 土壤中活跃微生物细胞内的脱氢酶在代谢过程中，将从有机底物（通常利用土壤本身的内源底物，或添加如葡萄糖等外源底物）脱下的氢（H⁺ + e⁻）传递给INT分子。
  3. 产物形成： INT（无色或淡黄色）接受氢原子后被还原，生成不溶于水的红色甲臜（INT-formazan）结晶。
  4. 定量测定： 孵育结束后，用有机溶剂（如甲醇、乙醇、丙酮或它们的混合物）将生成的INT-formazan从土壤中提取出来。提取液经离心或过滤去除土壤颗粒后，在特定波长（INT-formazan的最大吸收峰通常在490nm左右）下测定其吸光度值。
  5. 活性计算： 吸光度值与生成的INT-formazan量成正比。通过与已知浓度的INT-formazan标准曲线进行比较，计算单位时间内单位质量干土中生成的INT-formazan量（通常表示为μg INT-formazan g⁻¹ dry soil h⁻¹ 或 nmol INT-formazan g⁻¹ dry soil h⁻¹），该值即代表土壤脱氢酶活性。
 

三、 实验材料与仪器

  • 土壤样品： 新鲜采集的土壤（避免风干或冻存，最好立即处理或4°C短期保存），需过筛（通常2mm）去除石块和植物残体，混匀。
  • 化学试剂：
    • INT (2-对碘苯基-3-对硝基苯基-5-苯基氯化四唑)：分析纯。
    • 缓冲液母液：常用1M Tris-HCl缓冲液（pH 7.0-7.6）或1M 磷酸盐缓冲液（pH 7.0-7.6）。
    • INT基质工作液：用相应缓冲液配制适宜浓度的INT溶液（如1.0 mg/mL INT in Tris-HCl buffer pH 7.6）。临用前配制或避光冷藏保存。
    • INT-formazan标准品：用于绘制标准曲线。
    • 提取溶剂：甲醇、无水乙醇、丙酮或甲醇:丙酮 (1:1 v/v) 等。
    • 氯化钙 (CaCl₂) 溶液：1M，用于终止反应（可选）。
  • 仪器设备：
    • 恒温培养箱（或水浴振荡器）：控温精确至±0.5°C，通常设定37°C。
    • 分光光度计：配备490nm波长滤光片或可调波长。
    • 离心机：可达到3000-4000 rpm。
    • 漩涡混合器。
    • 分析天平（精度0.001g）。
    • 移液器及相应吸头（常用量程：100 μL, 1 mL, 5 mL）。
    • 离心管（带盖，如50mL）。
    • 比色皿（光程通常1cm）。
    • 振荡器（可选，用于提取）。
    • 烘箱：用于测定土壤水分含量。
    • 滤纸或过滤器（可选，替代离心）。
 

四、 操作步骤

  1. 样品准备：
    • 称取一定量（通常2.00 - 10.00g）新鲜湿土于无菌离心管中。
    • 同时称取等量土壤测定含水量（105°C烘干至恒重）。
  2. 酶促反应：
    • 向装有湿土的离心管中加入适量（通常5 - 10mL）预温至37°C的INT基质工作液。确保土壤与溶液充分混匀（可轻微振荡或涡旋）。
    • 设置对照：设置土壤对照（加入等体积不含INT的缓冲液）和基质对照（只有INT基质工作液，无土壤）。每个样品建议至少3个重复。
    • 将离心管盖紧，放入37°C恒温培养箱中避光孵育。孵育时间需根据土壤活性预实验确定（通常1-6小时，避免反应进入平台期）。
  3. 终止反应与产物提取：
    • 孵育结束后，立即加入适量（通常与基质液等体积）预冷的1M CaCl₂溶液（可选，有助于絮凝）或直接加入适量（如20-30mL）预冷的提取溶剂（如甲醇）。
    • 剧烈振荡（或用涡旋混合器）10-30秒，确保充分混匀，使生成的INT-formazan溶解到溶剂中。
    • 将离心管置于振荡器上振荡提取10-30分钟（或静置提取更长时间），或在4°C避光放置过夜。
  4. 离心/过滤：
    • 将提取液在3000-4000 rpm下离心10-15分钟，使土壤沉淀，上层为含INT-formazan的红色上清液。
    • （或）将土壤悬液用滤纸快速过滤，收集红色滤液。
    • 小心吸取上清液/滤液至干净的试管或比色皿中。若溶液浑浊，可再次离心或过滤。
  5. 比色测定：
    • 用提取溶剂（如甲醇）作为空白，在490nm波长下测定样品液、土壤对照液和基质对照液的吸光度（A<sub>490</sub>）。
  6. 土壤含水率测定：
    • 另取等量湿土，称重（W<sub>湿</sub>）后在105°C烘箱中烘干至恒重（通常至少24小时），称重（W<sub>干</sub>）。
    • 土壤含水率（%）= [(W<sub>湿</sub> - W<sub>干</sub>)/ W<sub>干</sub>] * 100%
    • 干土重（g干土）= W<sub>湿</sub> / (1 + 含水率/100)
 

五、 结果计算

  1. 净吸光度： A<sub>样品净</sub> = A<sub>样品</sub> - (A<sub>土壤对照</sub> + A<sub>基质对照</sub>)
    • 注：如果基质对照和土壤对照吸光度很小且稳定，有时可简化计算。
  2. 标准曲线： 用标准INT-formazan溶液（不同浓度梯度）在490nm下测吸光度，绘制浓度(C, μg/mL 或 nmol/mL) - 吸光度(A<sub>490</sub>)的标准曲线，得到线性回归方程：C = k * A<sub>490</sub> + b。
  3. 计算提取液中INT-formazan浓度： 利用标准曲线方程和A<sub>样品净</sub>计算样品提取液中INT-formazan的浓度(C<sub>提取</sub>, μg/mL 或 nmol/mL)。
  4. 计算生成的INT-formazan总量： 总量(M<sub>formazan</sub>) = C<sub>提取</sub> * V<sub>提取</sub>
    • V<sub>提取</sub>为最终提取液的总体积（mL）。
  5. 计算土壤脱氢酶活性(SDHA)：
    • SDHA活性 = M<sub>formazan</sub> / (W<sub>干土</sub> * T)
    • W<sub>干土</sub>：反应体系中干土的质量（g）。
    • T：孵育时间（小时，h）。
    • 单位： μg INT-formazan g⁻¹ dry soil h⁻¹ 或 nmol INT-formazan g⁻¹ dry soil h⁻¹
 

六、 注意事项

  1. 土壤新鲜度： SDHA活性对土壤状态敏感。强烈建议使用新鲜土壤样品（采集后尽快处理，4°C保存不超过1周）。 风干或冻存会显著降低酶活性。
  2. 内源底物： 标准方法通常利用土壤本身所含的有机质作为底物。如需使用外源底物（如葡萄糖），应在基质工作液中添加，并评估其对结果的潜在影响。
  3. INT浓度与孵育时间： INT浓度过低或孵育时间过长可能导致反应不完全或进入平台期。应根据土壤类型和活性进行预实验优化，确保反应在初始速率阶段进行（吸光度增加与时间呈线性关系）。
  4. 基质pH值： 缓冲液pH对酶活性至关重要，通常选择接近土壤自然pH或酶最适pH（约pH 7-8）。使用Tris或磷酸盐缓冲液维持稳定pH环境。
  5. 避光操作： INT和INT-formazan对光敏感，整个孵育和提取过程应在避光或暗处进行。
  6. 提取效率： 确保选择合适的有机溶剂并充分振荡/振荡提取，以最大程度溶解INT-formazan。提取溶剂体积应足够大。
  7. 温度控制： 孵育和离心（若需）温度应保持一致（通常37°C孵育，4°C离心/提取）。
  8. 离心/过滤彻底性： 确保提取液清澈透明，无土壤颗粒干扰吸光度测定。
  9. 准确称量： 土壤样品和试剂的称量务必精确。
  10. 设置对照： 土壤对照（消除土壤色素干扰）和基质对照（消除试剂背景）是保证结果准确的关键。
  11. 数据报告： 清晰标明活性单位（μg或nmol INT-formazan g⁻¹ dry soil h⁻¹）以及所用INT浓度、缓冲液类型与pH、孵育时间、温度等关键实验条件。
 

七、 应用价值

土壤脱氢酶活性作为土壤微生物群落代谢活性的有效指标，其检测具有重要的生态与环境意义：

  1. 土壤健康诊断： 高SDHA活性通常表明土壤微生物活性旺盛，有机质转化和养分循环速率快，是土壤健康、肥沃的重要标志。
  2. 污染生态风险评估：
    • 重金属污染： 重金属（如Cd, Pb, Cu, Zn）常显著抑制SDHA活性，是评估重金属污染对土壤微生物群落毒性效应的常用终点。
    • 有机污染： 农药、石油烃、多环芳烃（PAHs）等有机污染物对SDHA活性的抑制或（在可降解情况下）潜在的刺激作用，可用于评价污染物的生态毒性和生物修复潜力。
  3. 农业管理评价：
    • 评估不同施肥策略（有机肥/无机肥）、耕作方式（常规耕作/免耕/少耕）、轮作制度、覆盖作物、灌溉管理等对土壤生物学质量的影响。
    • 有机农业管理常伴随更高的SDHA活性。
  4. 土壤修复效果监测： 在污染土壤的生物修复、退化土壤的生态恢复过程中，SDHA活性变化可作为指示修复效果和土壤生物学功能恢复进程的重要生物标志物。
  5. 基础土壤生物学研究： 研究土壤微生物活性对环境因子（温度、水分、pH、养分）变化的响应机制。
 

八、 总结

土壤脱氢酶（SDHA）活性检测，特别是基于INT/TTC还原的比色法，是一种相对简便、快速且能灵敏反映土壤整体微生物代谢活性的标准方法。通过严格控制土壤新鲜度、优化反应条件（INT浓度、pH、温度、时间）、确保高效的产物提取和准确的比色测定，并设置必要的对照，可以获得可靠的土壤生物学活性数据。该指标在土壤健康评价、环境污染监测、农业可持续性评估及生态修复等领域发挥着不可替代的作用，为理解和管理土壤生态系统提供了重要的生物学依据。研究人员需根据具体研究目的和土壤特性，审慎解读SDHA活性数据，通常结合其他土壤理化及生物学指标进行综合评估。

参考文献（示例格式）

  • Casida, L. E. Jr., Klein, D. A., & Santoro, T. (1964). Soil dehydrogenase activity. Soil Science, 98(6), 371-376. (经典方法奠基文献)
  • Thalmann, A. (1968). Zur Methodik der Bestimmung der Dehydrogenaseaktivität im Boden mittels Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC). Landwirtschaftliche Forschung, 21(1), 249-258.
  • Tabatabai, M. A. (1994). Soil enzymes. In R. W. Weaver, S. Angle, P. Bottomley, D. Bezdicek, S. Smith, A. Tabatabai, & A. Wollum (Eds.), Methods of Soil Analysis: Part 2 Microbiological and Biochemical Properties (pp. 775-833). SSSA Book Series No. 5. Soil Science Society of America. (标准方法参考书章节)
  • García, C., Hernández, T., & Costa, F. (1997). Potential use of dehydrogenase activity as an index of microbial activity in degraded soils. Communications in Soil Science and Plant Analysis, 28(1-2), 123-134. (应用实例)
  • ISO 23753-1:2019. Soil quality — Determination of dehydrogenases activity in soils — Part 1: Method using triphenyltetrazolium chloride (TTC). (国际标准方法，常用TTC作为底物)
  • Öhlinger, R. (1996). Dehydrogenase activity with the substrate TTC. In F. Schinner, R. Öhlinger, E. Kandeler, & R. Margesin (Eds.), Methods in Soil Biology (pp. 241-243). Springer. (详细操作步骤)
 

注意： 具体实验操作细节（如土壤称样量、INT基质浓度、缓冲液体积、孵育时间、提取溶剂选择与体积、离心参数等）应根据实验室条件和待测土壤类型进行预实验优化。以上描述提供了通用的原理、步骤框架和关键注意事项。