以下为完整的土壤酸性磷酸酶(S-ACP)活性检测标准化流程(不含任何商业品牌信息):
土壤酸性磷酸酶(S-ACP)活性检测方法
一、检测意义
土壤酸性磷酸酶水解有机磷化合物,释放植物可利用的无机磷,其活性反映土壤磷素转化能力及微生物代谢强度,是评估土壤肥力与生态系统功能的重要指标。
二、检测原理
以对硝基苯磷酸二钠(pNPP)为底物,在酸性缓冲液中,S-ACP催化其水解生成对硝基苯酚(pNP)。在碱性条件下,pNP呈黄色,通过405 nm波长比色测定吸光度,计算酶活性(以单位时间内每克土壤生成pNP的纳摩尔数表示)。
三、试剂配制
- 醋酸盐缓冲液(0.1 M, pH 5.0)
- 溶解13.6 g三水合乙酸钠(CH₃COONa·3H₂O)于900 mL超纯水。
- 用冰醋酸调节pH至5.0 ± 0.1,定容至1 L,4℃保存。
- 底物溶液(0.05 M pNPP)
- 称取0.139 g对硝基苯磷酸二钠(C₆H₄NO₆PNa₂·6H₂O),溶于10 mL醋酸盐缓冲液,现用现配。
- 终止显色剂(0.5 M NaOH)
- 溶解20.0 g氢氧化钠于1 L超纯水。
- pNP标准贮备液(1 mM)
- 准确称取0.1391 g对硝基苯酚(C₆H₅NO₃),溶于超纯水,定容至1 L。
四、实验步骤
- 样品处理
- 取新鲜过2 mm筛土壤1.00 g(精确至0.001 g)于50 mL离心管。
- 对照管:加4 mL醋酸盐缓冲液。
- 样品管:加4 mL底物溶液。
- 温育反应
- 37℃恒温振荡(120 rpm)避光反应60 min。
- 终止与显色
- 立即加入4 mL 0.5 M NaOH终止反应,摇匀。
- 离心过滤
- 4000×g离心10 min,取上清液经0.45 μm滤膜过滤。
- 比色测定
- 以超纯水为参比,在405 nm波长测定样品吸光度(As)和对照吸光度(Ac)。
五、标准曲线绘制
pNP浓度 (μmol/mL) | 0 | 0.02 | 0.04 | 0.06 | 0.08 | 0.10 |
---|---|---|---|---|---|---|
吸光度 (405 nm) | 0.000 | 0.105 | 0.212 | 0.318 | 0.419 | 0.528 |
注:梯度稀释1 mM pNP贮备液,加NaOH后同法测定 |
六、结果计算
酶活性(nmol·g⁻¹·h⁻¹)= < data-sourcepos="null:null-null:null" xmlns="http://www.w3.org/1998/Math/MathML">
- < data-sourcepos="null:null-null:null" xmlns="http://www.w3.org/1998/Math/MathML">
>:样品与对照吸光度A s , A c A_s, A_c - < data-sourcepos="null:null-null:null" xmlns="http://www.w3.org/1998/Math/MathML">
>:反应体系体积(mL)V V - < data-sourcepos="null:null-null:null" xmlns="http://www.w3.org/1998/Math/MathML">
>:稀释倍数D D - < data-sourcepos="null:null-null:null" xmlns="http://www.w3.org/1998/Math/MathML">
>:pNP摩尔消光系数(18.3 L·μmol⁻¹·cm⁻¹)E E - < data-sourcepos="null:null-null:null" xmlns="http://www.w3.org/1998/Math/MathML">
>:反应时间(h)t t - < data-sourcepos="null:null-null:null" xmlns="http://www.w3.org/1998/Math/MathML">
>:土壤干重(g)m m
七、注意事项
- 使用新鲜土样(-80℃保存≤7天),避免反复冻融。
- 底物pNPP需避光冷藏,临用前配制。
- 严格控制温育温度±0.5℃及反应时间±0.5 min。
- 高有机质土壤需增加离心力至10000×g防止胶体干扰。
- 每批次样品需同步测定标准曲线(R²≥0.995)。
本方法依据国际标准ISO/TS 22939:2019《土壤酶活性测定》优化,适用于农业、森林及污染修复土壤的酸性磷酸酶活性评估。实验数据需结合土壤pH(S-ACP最适pH 4.5-6.0)进行生物学解释。