土壤酸性磷酸酶(S-ACP) 活性检测

发布时间:2025-06-28 08:01:39 阅读量:2 作者:生物检测中心

以下为完整的土壤酸性磷酸酶(S-ACP)活性检测标准化流程(不含任何商业品牌信息):


土壤酸性磷酸酶(S-ACP)活性检测方法

一、检测意义
土壤酸性磷酸酶水解有机磷化合物,释放植物可利用的无机磷,其活性反映土壤磷素转化能力及微生物代谢强度,是评估土壤肥力与生态系统功能的重要指标。

二、检测原理
以对硝基苯磷酸二钠(pNPP)为底物,在酸性缓冲液中,S-ACP催化其水解生成对硝基苯酚(pNP)。在碱性条件下,pNP呈黄色,通过405 nm波长比色测定吸光度,计算酶活性(以单位时间内每克土壤生成pNP的纳摩尔数表示)。

三、试剂配制

  1. 醋酸盐缓冲液(0.1 M, pH 5.0)
    • 溶解13.6 g三水合乙酸钠(CH₃COONa·3H₂O)于900 mL超纯水。
    • 用冰醋酸调节pH至5.0 ± 0.1,定容至1 L,4℃保存。
  2. 底物溶液(0.05 M pNPP)
    • 称取0.139 g对硝基苯磷酸二钠(C₆H₄NO₆PNa₂·6H₂O),溶于10 mL醋酸盐缓冲液,现用现配。
  3. 终止显色剂(0.5 M NaOH)
    • 溶解20.0 g氢氧化钠于1 L超纯水。
  4. pNP标准贮备液(1 mM)
    • 准确称取0.1391 g对硝基苯酚(C₆H₅NO₃),溶于超纯水,定容至1 L。
 

四、实验步骤

  1. 样品处理
    • 取新鲜过2 mm筛土壤1.00 g(精确至0.001 g)于50 mL离心管。
    • 对照管:加4 mL醋酸盐缓冲液。
    • 样品管:加4 mL底物溶液。
  2. 温育反应
    • 37℃恒温振荡(120 rpm)避光反应60 min。
  3. 终止与显色
    • 立即加入4 mL 0.5 M NaOH终止反应,摇匀。
  4. 离心过滤
    • 4000×g离心10 min,取上清液经0.45 μm滤膜过滤。
  5. 比色测定
    • 以超纯水为参比,在405 nm波长测定样品吸光度(As)和对照吸光度(Ac)。
 

五、标准曲线绘制

pNP浓度 (μmol/mL) 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10
吸光度 (405 nm) 0.000 0.105 0.212 0.318 0.419 0.528
注:梯度稀释1 mM pNP贮备液,加NaOH后同法测定            

六、结果计算
酶活性(nmol·g⁻¹·h⁻¹)= < data-sourcepos="null:null-null:null" xmlns="http://www.w3.org/1998/Math/MathML">(AsAc)×V×DE×t×m\frac{(A_s - A_c) \times V \times D}{E \times t \times m}

  • < data-sourcepos="null:null-null:null" xmlns="http://www.w3.org/1998/Math/MathML">As,AcA_s, A_c:样品与对照吸光度
  • < data-sourcepos="null:null-null:null" xmlns="http://www.w3.org/1998/Math/MathML">VV:反应体系体积(mL)
  • < data-sourcepos="null:null-null:null" xmlns="http://www.w3.org/1998/Math/MathML">DD:稀释倍数
  • < data-sourcepos="null:null-null:null" xmlns="http://www.w3.org/1998/Math/MathML">EE:pNP摩尔消光系数(18.3 L·μmol⁻¹·cm⁻¹)
  • < data-sourcepos="null:null-null:null" xmlns="http://www.w3.org/1998/Math/MathML">tt:反应时间(h)
  • < data-sourcepos="null:null-null:null" xmlns="http://www.w3.org/1998/Math/MathML">mm:土壤干重(g)
 

七、注意事项

  1. 使用新鲜土样(-80℃保存≤7天),避免反复冻融。
  2. 底物pNPP需避光冷藏,临用前配制。
  3. 严格控制温育温度±0.5℃及反应时间±0.5 min。
  4. 高有机质土壤需增加离心力至10000×g防止胶体干扰。
  5. 每批次样品需同步测定标准曲线(R²≥0.995)。
 

本方法依据国际标准ISO/TS 22939:2019《土壤酶活性测定》优化,适用于农业、森林及污染修复土壤的酸性磷酸酶活性评估。实验数据需结合土壤pH(S-ACP最适pH 4.5-6.0)进行生物学解释。