土壤蔗糖酶(S-SC)活性检测方法
一、引言
土壤蔗糖酶(S-SC)是反映土壤碳循环与有机质转化强度的关键酶,催化蔗糖水解为葡萄糖和果糖。其活性高低直接影响土壤供肥能力与微生物活性,是评估土壤健康及肥力的重要生物指标。本方法基于经典比色法(3,5-二硝基水杨酸法,DNS法),适用于实验室常规分析。
二、测定原理
在适宜温度与pH下,土壤中的蔗糖酶将蔗糖水解为还原糖(葡萄糖、果糖)。生成的还原糖在碱性条件下与3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂共热,发生显色反应(棕红色),其颜色深度与还原糖含量成正比。通过分光光度计测定吸光度,即可计算出蔗糖酶活性(通常以单位土重在单位时间内产生的葡萄糖毫克数表示)。
三、试剂与材料
- DNS试剂: 精确称取3,5-二硝基水杨酸溶于水,加入氢氧化钠溶液、酒石酸钾钠、苯酚和亚硫酸钠,溶解定容(避光保存)。
- 0.1 M pH 5.5 醋酸缓冲液: 按比例混合醋酸钠溶液与醋酸溶液,校正pH。
- 8% 蔗糖溶液: 溶解蔗糖于醋酸缓冲液中。
- 葡萄糖标准溶液(1 mg/mL): 精确称取无水葡萄糖定容。
- 甲苯(分析纯)。
- 仪器: 分光光度计、恒温水浴振荡器、离心机、分析天平、离心管、比色管/皿、移液器、计时器。
四、操作步骤
- 样品准备: 新鲜土壤样品过2 mm筛,充分混匀。
- 培养反应:
- 称取5.00 g土样(精确至0.01 g),置于50 mL离心管中。
- 加入0.5 mL甲苯(溶解细胞膜,暴露胞外酶),轻摇混匀,放置15分钟。
- 加入10 mL 8%蔗糖溶液(底物),充分振荡混匀。
- 同时设置:
- 样品管: 土样 + 甲苯 + 蔗糖溶液
- 无底物对照管: 土样 + 甲苯 + 醋酸缓冲液(代替蔗糖溶液)
- 无土壤对照管: 醋酸缓冲液 + 甲苯 + 蔗糖溶液(评估试剂背景)
- 所有管盖紧塞,置于37±0.5℃恒温水浴振荡器中,避光培养24小时(转速约100-150 rpm)。
- 终止反应与显色:
- 培养结束后,立即加入10 mL蒸馏水,振荡混匀。
- 离心(约4000 rpm, 10 min)或过滤,取上清液备用。
- 取1.0 mL上清液(或滤液)加入干燥试管。
- 加入2.0 mL DNS试剂,摇匀。
- 将试管置于沸水浴中准确加热5分钟进行显色反应。
- 取出后立即用冷水冷却至室温。
- 用蒸馏水定容至25 mL(或适量),充分混匀。
- 比色测定:
- 在波长540 nm处,用1 cm比色皿,以无土壤对照管的对应反应液作参比调零,测定样品管和无底物对照管反应液的吸光度(A样品、A无底物对照)。
- 标准曲线绘制:
- 配制葡萄糖标准系列溶液(0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 mg/mL)。
- 各取1.0 mL标准液,按步骤3(加入DNS、沸水浴、定容)操作显色。
- 以540 nm吸光度(A)为纵坐标,葡萄糖浓度(mg/mL)为横坐标,绘制标准曲线,求得回归方程(y = kx + b)。
五、结果计算
- 计算样品净吸光度:
A净 = A样品 - A无底物对照
(扣除土壤自身产生的还原糖背景) - 查算葡萄糖含量:
根据A净
值代入葡萄糖标准曲线回归方程,计算出反应液中葡萄糖浓度(C,mg/mL)。 - 计算蔗糖酶活性(S-SC):
S-SC活性 (mg Glucose / g Soil / 24h) = (C * V总 * V定) / (W * V样 * T)
(单位:毫克葡萄糖 / 克干土 / 24小时)C
:由标准曲线查得的反应液中葡萄糖浓度(mg/mL)V总
:反应结束时加入的稀释液总体积(本步骤中为10mL水 + 10mL蔗糖/缓冲液初始体积,通常为20 mL)V定
:显色后定容体积(通常为25 mL)W
:土壤样品干重(g)。若为鲜土,需乘以(1 - 土壤含水率%) 换算成干土重。V样
:用于显色测定的上清液体积(通常为1 mL)T
:培养时间(通常为24小时)
六、注意事项
- 样品新鲜性: 尽量使用新鲜土壤样品,若需保存,应低温(4℃)短期存放,避免冷冻。
- 温度控制: 培养温度(37℃)必须精确恒定,水浴振荡确保样品充分接触。
- 时间控制: 培养时间(24h)和显色加热时间(5min)需严格控制。
- 背景扣除: “无底物对照”用于扣除土壤自身产生的还原糖干扰,“无土壤对照”用于评估试剂背景。
- 显色稳定性: 显色后溶液应尽快完成比色测定,避免放置过久颜色变化。
- 试剂质量: 蔗糖、葡萄糖、DNS试剂纯度需保证。底物溶液避免微生物污染。
- 离心/过滤: 确保上清液/滤液澄清,避免土壤颗粒干扰比色。
- 土壤质地: 对于有机质或粘粒含量极高的土壤,可能需要调整土样称量或稀释倍数以保证在检测线性范围内。
- 结果报告: 注明培养温度和时间(如37℃, 24h),并报告干土重计算结果。
七、方法评价与应用
本方法操作相对简便,灵敏度与重现性较好,是评估土壤碳素转化潜力与微生物活性的常用手段。其测得活性主要反映胞外酶活性。结果可用于:
- 比较不同土壤类型或管理措施(如施肥、耕作、污染)对土壤生物学活性的影响。
- 评价土壤有机质分解与养分循环速率。
- 监测土壤健康状况与恢复进程。
- 作为构建土壤质量综合指标的生物学参数之一。
参考文献 (示例性引用经典方法学著作)
- 关松荫 等. 《土壤酶及其研究法》. 农业出版社.
- Schinner, F., von Mersi, W. (1990). Xylanase-, CM-cellulase- and invertase activity in soil: an improved method. Soil Biology and Biochemistry, 22(4), 511–515.
- Alef, K., & Nannipieri, P. (Eds.). (1995). Methods in Applied Soil Microbiology and Biochemistry. Academic Press. (书中包含标准酶活性测定方法)
说明: 本方法描述力求完整、通用、中立,严格遵循学术规范,未提及任何特定商业产品或机构名称。实际应用中,请根据实验室条件和土壤特性进行必要的优化与验证。